中國蘋果加工業發展迅速，但是原料匱乏，加工利用品種混雜嚴重，質量差等問題是產業發展的障礙。因此從現有的蘋果資源中篩選適宜加工的品種，構建適宜加工蘋果品種指紋圖譜，了解其遺傳關系，將有助于推動中國蘋果加工品種的生產推廣進程，加速育種利用和種質創新。適宜加工用的蘋果品種介紹已經有較多的報道（王昆 等，2007；王冬梅 等，2010）。劉金豹（2004）利用10 個從國外引進的加工專用蘋果品種，研究了果實中與加工品質有關的指標及在果實發育進程中的變化特征。宋燁等（2006a，2006b，2006c，2007，2008）對從法國引入的 16 個適宜制汁和釀酒的蘋果品種進行了遺傳多樣性和生物學特征研究，分析了主要品種果實糖代謝積累規律和酚類物質的組成及特性。聶繼云等（2006）選擇 8 項果實性狀指標（可溶性糖、可滴定酸、維生素 C、香氣、風味、果肉質地、汁液和異味）組成制汁用蘋果品質評價體系。
TP-M13-SSR（即 simple sequence repeat with tailed primer M13）分子標記技術是 SSR 擴增產物檢測過程中的一種基于熒光測序技術的高通量低成本分析技術體系。Oetting（1995）首次將一段 19bp 的核苷酸序列（稱為 Tailed primer，即尾巴引物）引入到短串聯重復（short tandem repeat，STR）標記體系中，并與熒光分析技術和多重 PCR（Multiplex PCR）技術相結合。Schuelke（2000）又用M13 序列作為尾巴引物和通用引物對該技術體系進行了完善，最終實現了 SSR 技術與熒光自動測序技術的完美整合，形成了一套低成本的基于熒光測序技術的 SSR 擴增產物檢測體系，即 TP-M13-SSR技術。它需要一個具有普適性的用熒光標記的 M13 引物，并把 M13 的正向引物和一個 SSR 反向引物相連（稱為 TP-M13 引物），利用 3 條引物序列進行 PCR 擴增，其 PCR 產物在 DNA 測序儀上進行自動熒光檢測，其在較大程度上解決了分析通量較低、擴增產物檢測流程繁瑣、數據記錄的工作量過大等一系列問題。此方法已被應用到玉米、高粱等作物的遺傳多樣性、基因型鑒定等研究中（李會勇 等，2005；劉志齋 等，2007），高源等（2010，2011a，2011b，2012）也將其應用到了蘋果和梨種質資源的鑒定和遺傳多樣性研究中。
中國農業科學院農產品加工研究所和中國農業科學院果樹研究所分別利用建立的蘋果脆片品質評價體系和制汁用蘋果品質評價體系在“國家果樹種質興城梨、蘋果圃”中篩選出了 44 個適宜制汁和加工脆片的蘋果資源。
本研究中利用TP-M13-SSR分子標記的方法構建已經篩選出的44個適宜加工蘋果品種的指紋圖譜，并對其進行遺傳關系分析，旨在探明適宜加工用蘋果品種的遺傳譜系和親緣關系，研究適宜加工蘋果品種的加工特性和品質評價體系與遺傳關系的相關性，為完善蘋果加工品種的品質評價體系和培育加工品種提供參考。
1、 材料與方法
1.1 試驗材料
在國家果樹種質興城蘋果圃隨機選取 190 個蘋果品種的果實，分別在中國農業科學院果樹研究所和農產品加工研究所按照蘋果脆片品質評價體系和制汁用蘋果品質評價體系進行適宜性評價，篩選出 25 個適宜制汁和 19 個適宜加工脆片的品種，取其葉片用于構建指紋圖譜和遺傳關系分析。
1.2 基因組 DNA 的提取與引物合成
2011 年春季，采用德國 QIAGEN 的 DNeasy Plant Mini Kit 提取供試材料葉片的基因組 DNA。
在 TP-M13 自動熒光檢測系統中，用 3 條引物進行 PCR 擴增。第 1 條引物是把普通的 SSR 引物的正向引物分別和 M13 的正向引物相連合成帶有 M13 尾巴的引物，即 TP-M13 引物；第 2 條引物為正常的 SSR 反向引物；第 3 條引物是 5′端帶有熒光標記的 M13 正向引物。本試驗中篩選出的11 對普通 SSR 引物均來源于報道的序列（Liebhard et al.，2002；Yamamoto et al.，2002a，2002b），TP-M13-SSR 引物（表 2）由上海 Sangon 公司合成；5′端帶有熒光標記的 M13 正向引物（表 3）由美國 ABI 公司合成。
1.3 實驗程序與數據分析
具體實驗步驟和操作程序參照 Schuelke（2000）提供的巢式 PCR 和高源等（2010）對其優化后的程序和步驟。待電泳結束后，對樣品的原始數據用 GeneMapper3.0 軟件進行分析，獲得不同樣品擴增片段的長度；利用 NTSYSpc-2.10e 軟件中的 Dice 方法計算各品種之間的相似系數，采用 UPGMA 法進行聚類分析，繪制樹狀圖；再利用 PopGen32 對供試材料進行分析。
2、 結果與分析
2.1 篩選引物擴增的條件優化及 SSR 多態性
篩選的 11 對 TP-M13-SSR 引物優化后退火溫度見表 4。用 11 對 SSR 引物對 44 個蘋果適宜加工品種進行擴增，共獲得 134 個等位基因。不同引物擴增的等位基因數差異較大，為 4 ~ 24 個，平均每個位點 12.2 個等位基因；觀測雜合度（Ho）在 0.068 ~ 0.977 之間，平均值為 0.752；預期雜合度值（He）在 0.111 ~ 0.939 之間，平均值為 0.764（表 4）。
蘋果引物 CH04h02 多態性最高，獲得 24 個等位基因，位點雜合度也較高；梨引物 BGT23b多態性最低，獲得 4 個等位基因，位點雜合度也較低。引物 CH04h02 擴增片段大小范圍最大，為 155 ~ 281 bp，BGT23b 擴增片段大小范圍最小，為191 ~ 199 bp。CH04h02 擴增‘瑞光’（27）獲得的兩個等位基因的重復序列差異最大，分別為 155和 281 bp，差別為 126 個堿基。
此次篩選的 SSR 引物多態性較好，雜合度較高，適宜構建適宜加工蘋果品種 SSR 指紋圖譜；梨引物 BGT23b 雖然多態性相對較差，但是仍然可以作為指紋圖譜構建的補充 SSR 引物。
2.2 指紋圖譜構建與品種鑒定
利用篩選出的 11 對 TP-M13-SSR 引物對 44 個適宜加工蘋果品種進行擴增，準確獲得不同材料在不同位點的等位基因的片段大小及相應的毛細管電泳圖（圖 1）。例如：特早紅（1）在 SSR 位點 CH01f03b 的擴增片段大小為 163 bp 和 189 bp。每對引物的擴增帶型數為 4 ~ 35 個，平均為 21.5 個（表 4）。僅利用兩對引物 CH04h02 和 CH05d04 即可區分所有供試適宜加工蘋果品種。
具有相同親本的供試品種獲得的指紋圖譜差異較大，例如秋香（20）、紅月（39）和喬納金（32）的親本均為金冠 × 紅玉，秋香和紅月僅在位點 BGT23b 處指紋圖譜相同，而紅月和喬納金僅在位點 CH02b121、CH04g07 和 BGT23b 處指紋圖譜相同。44 個適宜加工蘋果品種的 TP-M13-SSR 指紋圖譜互不相同，可以作為各品種特定的圖譜，在直接推廣應用時，為品種鑒別提供重要依據。
2.3 遺傳多樣性分析
44 個品種 11 個 SSR 位點的香農指數的變化范圍分別為 0.278 ~ 2.881，平均值為 1.940。不同位點的等位基因頻率的變化差異較大，CH04h02 在 44 個品種中擴增出 24 個等位基因，有 7 個等位基因的頻率僅為 1.14%（表 6），等位基因頻率最高的也僅為 17.05%；而 BGT23b 擴增出 4 個等位基因，等位基因頻率最高的達 94.32%，但是每個位點均有頻率較低的等位基因出現。說明此次篩選出的適宜加工的蘋果品種遺傳基礎廣泛，基因雜合度高，有益于育種利用。
根據 44 個適宜加工蘋果品種在 11 個 SSR 位點的指紋圖譜數據，得出兩兩品種間的 Dice 相似系數。44 個品種的相似系數在 0.7259 ~ 0.9704 之間，其中以特早紅和秋映之間相似系數最低為0.7259，紫香蕉和丹頂之間相似系數最高，為 0.9704。適宜制汁的與適宜加工脆片的品種間的相似系數小于適宜制汁品種間或適宜加工脆片的品種間的相似系數，說明供試品種間遺傳差異大小不同，適宜制汁的品種間親緣關系較近，適宜加工脆片的品種間親緣關系也較近，而適宜制汁的與適宜加工脆片的品種間親緣關系較遠。
以相似系數進行聚類，在相似系數 0.798 處劃分供試品種（圖 2）。適宜制汁蘋果品種歸類明顯，除瑞光、馬空、紅月、蜜脆、珍寶、赤陽和短枝金冠，其余 18 個適宜制汁的蘋果品種均聚到了一起。
在相似系數 0.859 處，秋香（金冠 × 紅玉）、友誼（紅玉自然實生）、喬納紅（紅玉芽變）、紅玉和甜紅玉（紅玉芽變）緊密聚到一起，它們均具有相同的親本紅玉；在相似系數 0.831 處，綠帥（金冠實生）、金冠、喬納金（金冠 × 紅玉）緊密聚到一起，它們具有相同的親本金冠；在相似系數 0.845處，戀姬（拉里坦 × 富士）、富士和寒富（東光×富士）緊密聚到一起，他們具有相同的親本富士；另外，富士（國光 × 元帥）、寒富[東光 × 富士（國光 × 元帥）]、惠（國光 × 紅玉）、華紅[金冠 × 惠（國光 × 紅玉）]、千秋[東光 × 富士（國光 × 元帥）]和華富[富士（國光 × 元帥）花藥培養]均較近地聚到了一起，而它們系譜里均具有相同的親本國光。適宜加工脆片的蘋果品種聚類相互交錯，比較分散，甜黃魁、紅之舞、芳明、友誼、陽光、紅玉和富士 7 個適宜加工脆片的蘋果品種被聚在了適宜制汁的蘋果類群中，并與秋香、喬納紅、紅玉、甜紅玉、綠帥、金冠、喬納金等適宜制汁的蘋果品種聚在一起。說明適宜制汁的加工特性與遺傳關系的相關性要高于加工脆片的加工特性與遺傳關系的相關性。
3、 討論
3.1 適宜加工蘋果品種的 SSR 指紋圖譜
本研究中將 SSR 分子標記技術和熒光標記技術相結合，建立 TP-M13-SSR 分子標記技術體系，準確獲得適宜加工蘋果品種在 11 個 SSR 位點的指紋圖譜，重復性好。44 個品種的 TP-M13-SSR 指紋圖譜可以作為各品種特定的圖譜，作為品種鑒別重要依據，防止生產推廣過程中同名異物和同物異名的產生。SSR 標記屬于共顯性遺傳，子代獲得的等位基因與親本相關。本研究中，包含了較多以金冠或（和）紅玉作為親本的蘋果品種，但是其在 11 個位點獲得等位基因與親本金冠或（和）紅玉獲得的等位基因偶有不符合 SSR 共顯性遺傳規律的情況，可能是供試子代蘋果品種本身發生的變異。SSR 難以區分芽變品種，但在本研究中，喬納紅為紅玉芽變品種，利用 SSR 引物 CH04h02、CH05d04 和 CH01f07a 均可以把兩者區分開；斯塔克金矮生為金冠的芽變品種，除 SSR 引物 CH02b121和 CH04g07 其余 9 個 SSR 位點均可以把兩者區分開，說明芽變區域包含了可以將品種區分開的 SSR位點，證明了利用 SSR 不能區分芽變品種是與檢測的 SSR 位點數不足有關。
3.2 適宜加工蘋果品種的加工特性與其遺傳背景
供試的適宜制汁的蘋果品種大多數與金冠、紅玉或富士有親緣關系，在聚類分析中，與不同親本相關的品種分別聚成幾個類群，說明了適宜制汁蘋果品種遺傳背景比較相似，或是存在相似的品質性狀控制基因及其 SSR 連鎖標記。而適宜加工脆片的蘋果品種親本較雜，因此聚類也比較分散。
也可能是控制制脆片性狀的基因相對較少，其在遺傳背景總體中的分量較輕，因而不能在樹狀圖中凸顯出來。由此推測，制汁品質可能偏向于多基因控制的數量性狀控制，而加工脆片的特性可能偏向于寡基因控制的數量性狀控制。
3.3 適宜加工蘋果品種的品質評價體系的建立
聶繼云等（2006）對制汁用蘋果品質評價體系進行了探討，確定由 8 項指標組成。王沛等（2012a，2012b）測定了 15 個中早熟蘋果品種脆片的 16 項品質指標，并基于 16 項指標對 15 個品種的適宜加工脆片特性進行評價；之后又對 16 項品質評價指標進行相關性分析。由于基因之間連鎖等方面的原因，各個品質評價指標之間存在著不同程度的相關性。但是，目前由于加工工藝以及人的感官差別等因素，國內外研究者還未建立一個系統、全面且標準統一的蘋果脆片品質評價體系，同時也缺少儀器測定值與感官評價相關性研究（王沛 等，2010）。適宜加工脆片的品種與適宜制汁的品種的評價標準有差異，同時又有相重合的評價指標。適宜制汁和適宜加工脆片的品種雖各自聚成不同的類群，體現了不同的遺傳關系，但相似系數相對較高。蘋果加工品種的加工特性受遺傳關系影響。因此在不斷完善其品質評價體系的同時需要兼顧遺傳關系與加工特性的相關性。
3.4 適宜加工蘋果品種育種親本的選擇
此次篩選出的適宜加工的蘋果品種的親本多為金冠、紅玉、國光、富士和元帥，其中以金冠為親本的最多，以紅玉為親本的次之，含有國光血緣的再次之。這些品種可以作為加工品種的育種親本，加強利用。
