毛花獼猴桃（Actinidia eriantha Benth.）果肉翠綠色，風味較濃，具有較強的抗病性。目前商業栽培的獼猴桃種類主要是中華獼猴桃、美味獼猴桃（牛歆雨 等，2007），生產中應用的毛花獼猴桃品種極少。毛花獼猴桃絕大部分處于野生狀態，主要分布于長江以南的廣大丘陵地區，其中以江西、湖南、福建、廣西等地的野生種質資源最為豐富。毛花獼猴桃是獼猴桃屬植物中抗壞血酸（ascorbicacid，AsA）含量較高的種類之一，其果實中的 AsA 含量高達 5.00 ~ 13.79 mg · g-1FW，是中華獼猴桃的 3 ~ 4 倍（鐘彩虹 等，2011）。由于具有這些特性，毛花獼猴桃具有廣闊的開發利用前景。

近年來，國內外有關植物體內 AsA 的研究主要集中在抗氧化作用、光合保護、增強酶活性、促進細胞分裂、植物信號傳導等方面的功能分析、AsA 合成途徑與降解、轉運與運輸等生理代謝過程等方面。同時，在對植物抗壞血酸相關酶基因的研究上已在刺梨（安華明 等，2005）、柑橘（楊曉燕，2011）和獼猴桃（Laing et al.，2007；Bulley et al.，2009）等果樹中廣泛開展。而對于毛花獼猴桃的研究只側重于 AsA 合成途徑及相關基因的克隆等相關研究（Crowhurst et al.，2008；侯長明 等，2009）。有關野生毛花獼猴桃葉片和果實 AsA 含量與 SSR 標記的關聯分析尚未見報道。

關聯分析（association analysis，AA）作為在植物數量性狀研究和植物育種中的最新開始應用的一種分析方法，它通過鑒定種質群體內性狀與分子遺傳標記或候選基因的關系，可以使 QTL 分析得到補充和提高，使目標性狀精確定位并可廣泛應用而不受雜交群體的限制（楊小紅 等，2007）。根據掃描范圍，關聯分析可分為全基因組和候選基因兩種途徑（Flint et al.，2003）。全基因組關聯分析基于遺傳標記，可以對目標性狀進行染色體定位；而候選基因關聯分析則是對候選目的基因序列在種質間的差異進行研究，可以更加精確地鑒定優異等位基因。Hansen 等（2001）最早通過全基因組關聯分析尋找出與野生甜菜抽薹基因緊密連鎖的標記，加快了候選基因的定位進程。曹珂等（2012）在對桃的單果質量與6個物候期性狀的遺傳進行關聯分析研究時得到了27個與桃單果質量及6個物候期性狀關聯的數量性狀位點。文自翔等（2008）在對中國栽培和野生大豆農藝品質性狀與 SSR 標記的關聯分析中檢測出栽培群體的大豆和野生大豆種質中分別有 27 個和 34 個位點與農藝形狀性狀相關。Breseghello 和 Sorrells（2006）利用 18 個 SSR 標記對 95 份小麥品種的籽粒性狀進行了關聯分析，結果發現 Xwmc111、Xgwm30 和 Xgwm261 與籽粒寬度存在顯著相關。此外，全基因組關聯分析還在其他一些作物上得到了廣泛的應用，但在獼猴桃中尚未見報道。隨著關聯分析在分子遺傳育種和基因組學研究中的不斷深入，通過分子標記的開發、尋找候選基因及功能基因驗證的研究，為進一步揭示數量性狀的遺傳機制及作物的遺傳改良提供了新的途徑。

在對江西省武功山境內野生毛花獼猴桃資源調查收集的 70 份野生種質葉片和果實的 AsA 含量變異分析的基礎上（湯佳樂 等，2013），利用覆蓋全基因組的 SSR 引物分析其遺傳多態性，旨在為野生毛花獼猴桃資源的合理開發與利用奠定基礎。同時運用一般線性模型（general linear model，GLM）和混合線性模型（mixed linear model，MLM）進行野生毛花獼猴桃 AsA 含量的關聯分析，尋找與 AsA 含量相關的標記位點，為揭示野生毛花獼猴桃 AsA 生成的分子特征提供理論依據，以促進有效改良獼猴桃的果實性狀與種質創新。

1、 材料與方法

1.1 材料及其基因組 DNA 的提取

2012 年 7 月中旬在江西省武功山境內隨機采集 70 份野生狀態下毛花獼猴桃種質的健康無損傷的成熟葉片，用冰盒保存并運回實驗室。用 CTAB 法提取野生毛花獼猴桃幼嫩葉片的基因組 DNA，用紫外分光光度計檢測 DNA 質量和濃度，–20 ℃保存備用。

1.2 SSR 分析

參照 Testolin 等（2001）用 SSR 構建了獼猴桃遺傳連鎖圖，選用廣泛分布在獼猴桃基因組中 70對 SSR 引物（Palombi & Damiano，2002；Zhen et al.，2004；Korkovelos et al.，2008），首先對 8 個AsA 含量差異較大的野生毛花獼猴桃種質材料進行擴增，篩選出多態性較好的 21 對 SSR 引物，再對 70 份野生毛花獼猴桃種質資源進行擴增。PCR 擴增程序為 94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性 45 s，50 ~ 60 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 45 s，30 個循環；72 ℃延伸 10 min。擴增產物用 10%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，快速銀染法染色。

1.3 數據統計分析

利用 Microsoft Office Excel 對野生毛花獼猴桃成葉和幼果的 AsA 含量進行統計，根據丙烯酰胺凝膠電泳和銀染檢測的結果，將每條 SSR 引物擴增的每一條帶視為 1 個位點，統計位點總數和多態性位點數多態性信息含量（PIC）等參數值，相同遷移率的記為 1，無條帶的記為 0，不具多態性的條帶不予統計。應用 Structure 2.3.1 軟件進行群體遺傳結構分析，并計算材料相應的群體結構 Q 值以確定 70 份野生毛花獼猴桃種質群體的遺傳結構。先假定各個位點均是獨立的，并估算最佳群體數（K），K 的取值范圍為 2 ~ 10，將 MCMC（markov chain monte carlo）開始時的不作數迭代（lengthof burn-in period）設為 10 000 次，再將不作數迭代后的 MCMC 設為 10 000 次，然后選取一個合適的親緣關系 K 值。

分別應用 Tassel 2.1 軟件中 GLM 和 MLM 兩種程序進行野生毛花獼猴桃 AsA 含量與 SSR 標記位點的關聯分析。GLM 分析中以 Q 值作為協變量進行回歸分析；MLM 采用群體結構 Q 值和親緣關系 K 值相結合的方法進行分析，選擇計算每個標記的遺傳力（calculate heritability for each marker）的計算方式，分析方法選擇 EM。利用 AsA 含量表型變異數據對標記逐一進行回歸分析和關聯作圖，并計算標記對表型變異的解釋率。

2、 結果與分析

2.1 SSR 多態性分析

利用 70 條廣泛分布于獼猴桃基因組的 SSR 引物對野生毛花獼猴桃材料進行擴增，52 條引物能夠擴增出條帶，且每條引物能夠擴增出 2 ~ 12 條帶。再對 52 條 SSR 引物進行篩選，得到穩定性好、擴增性強和多態性好的 SSR 引物 21 條，一共擴增出 127 個多態性等位位點。通過對野生毛花獼猴桃基因組 PCR 擴增，多數 SSR 引物能夠在野生毛花獼猴桃材料中表現出多態性，不同的 SSR 引物的擴增結果在總等位位點數、多態性位點數、等位位點亮度等方面都表現出了差異。在 70 份毛花獼猴桃材料中，21 條 SSR 引物擴增得到的基因片度長度大概在 75 ~ 400 bp 的變化范圍，等位位點數目在 2 ~ 12 之間，平均每條 SSR 引物可以檢測到 6.04 個等位位點，其中引物 722 檢測到了 5 個等位位點變異（圖 1）。利用 SSR 標記對野生毛花獼猴桃擴增得到的圖譜，將擴增得到的多態性位點進行賦值進行關聯分析。

2.2 群體結構分析

為了估測野生毛花獼猴桃種質群體的遺傳結構，基于 SSR 標記的數據，利用 Structure 2.3.1 軟件的等位基因發生頻率相關模型進行群體結構分析。對 70 份野生毛花獼猴桃種質進行組群劃分結果測試，重復 10 次，2 ~ 10 組群（K = 2，3，4，……，10），將測試過程中不同的等位變異頻率特征類型數 K 給出的不同的 lnP（D）平均值（似然值），繪制成散點圖（圖 2）?；跀祵W模型的群體結構分析發現樣本中的 lnP（D）隨著 K 值得增加呈持續增大。因此，最佳的群體結構數必須通過 ΔK 來確定。由圖 3 可以看出，ΔK 在 K = 4 出現拐點。根據 Evanno 等（2005）的描述，可以判斷 70 份野生毛花獼猴桃群體可被分為 4 個亞群（圖 4）。這 4 個亞群分別包含 14、17、21 和 18 份材料。

2.3 SSR 標記與 AsA 含量的關聯分析

從前期研究結果（湯佳樂 等，2013）中發現，70 份野生狀態下的毛花獼猴桃桃種質資源不同植株的成熟葉片和幼嫩果實 AsA 含量存在豐富的變異，變異系數分別為 41.30%和 21.88%，反映了野生毛花獼猴桃種質中存在較大的的遺傳差異。本研究中則是基于對野生毛花獼猴桃準確測定成熟葉片和幼嫩果實的基礎上，經過 SSR 多態性分析和群體遺傳結構分析，將野生毛花獼猴桃群體分為4 個亞群，應用 Tassel 2.1 軟件中的 GLM 模型和 MLM 模型兩種程序進行野生毛花獼猴桃葉片和果實 AsA 含量與 SSR 標記的關聯分析。

在 GLM 模型中，以 4 個亞群中的各個材料所對應的群體結構 Q 值作為協變量，將 SSR 標記與AsA 含量的變異進行回歸分析，尋找與 AsA 含量相關聯的標記并確定其解釋率；在 MLM 模型中，采用群體結構 Q 值和親緣關系 K 值相結合的方法進行回歸分析，并確定其相關聯標記的解釋率。

GLM 模型分析結果（表 1）顯示，在 P < 0.01 水平上，所檢測的 21 對 SSR 引物的 127 個多態性標記位點中，有 7 個 SSR 標記位點與葉片和果實的 AsA 含量相關。有 4 個標記位點與葉片的 AsA含量相關，4 個與果實的 AsA 含量相關，其中標記位點 UDK97-414 同時與葉片的 AsA 含量、果實的 AsA 含量相關。各個 SSR 標記位點對葉片和果實 AsA 含量的變異的解釋率在 0.082 5 ~ 0.175 5之間，解釋率最大的標記位點是 UDK96-040，為 0.175 5，與果實的 AsA 含量相關，其次是標記位點 UDK96-053，解釋率為 0.168 9；而解釋率最小的標記位點是 761，解釋率為 0.082 5，與葉片的AsA 含量相關。

MLM 模型分析的結果（表 1）顯示，在 P < 0.01 的水平上，共有 6 個 SSR 標記位點分別與葉片和果實 AsA 含量相關，比 GLM 模型分析結果中的少 1 個，其中有 5 個 SSR 標記位點與 GLM 模型分析所得到的相同，標記位點 751 只有在 MLM 模型分析中檢測到，與葉片的 AsA 含量相關的解釋率為 0.073 6。標記位點 UDK97-414 同時與葉片和果實的 AsA 含量相關。MLM 模型中各個標記位點的解釋率在 0.076 3 ~ 0.154 6 之間，低于 GLM 模型分析得到的解釋率。

3、 討論

3.1 野生毛花獼猴桃 SSR 多態性及群體結構分析

AsA 含量作為衡量果實品質中一個重要的指標，選育出高果實 AsA 含量的品種一直是育種工作者的目標之一。因此分析毛花獼猴桃 AsA 含量的多樣性以及基于 SSR 分子標記的多態性分析，對于獼猴桃育種工作具有重要的指導意義。本研究中以 AsA 含量變異豐富的野生毛花獼猴桃種質為材料，在前期進行葉片和果實 AsA 含量變異分析的基礎上（湯佳樂 等，2013），利用 SSR 分子標記進行多態性分析，21 條多態性高的 SSR 引物一共檢測出 127 個等位變異位點，擴增得到的基因片度長度大概在 75 ~ 400 bp 的變化范圍，變異范圍在 2 ~ 12 之間，平均每條 SSR 引物可檢測到 6.04個等位位點?？梢?，野生毛花獼猴桃不僅在葉片和果實 AsA 含量上具有豐富的多樣性，而且基于SSR 分子標記在對野生毛花獼猴桃種質材料的識別和區分上也具有多態性高的特點。野生毛花獼猴桃葉片和果實 AsA 含量變異的多樣性及基于 SSR 的多態性分析結果表明，本研究所選擇的資源群體適合于開展野生毛花獼猴桃 AsA 含量的關聯分析。通過對野生毛花獼猴桃種質材料的葉片和果實AsA 含量與 SSR 標記的關聯分析，將有助于深入發掘并充分利用高 AsA 含量的基因資源，加速高AsA 含量基因的研究和育種改良。

對供試種質資源進行遺傳多樣性和群體遺傳結構評價，是進行關聯分析的前提和基礎（Harris &Stokesbury，2010）。本研究中使用 STRUCTURE 軟件對供試野生毛花獼猴桃種質進行的基于 SSR標記的群體結構分析，70 份供試種質可以分為 4 個亞群，分別包含 14、17、21 和 18 份材料。群體分析的結果分析是通過計算各個供試種質相應的 Q 值，進行基于數學模型的聚類劃分，通過將野生毛花獼猴桃群體中各個種質的所得到相應的 Q 值作為協變量納入回歸分析中，校正了 70 份種質材料的群體結構，較大程度上減少群體結構對關聯分析的影響，降低供試種質群體結構引起的偽關聯的概率，進而有效提高了關聯分析的準確性。

3.2 野生毛花獼猴桃 SSR 標記的關聯分析

近年來，關聯分析已成功應用于植物研究。顧竟等（2011）采用 GLM 一般線性模型，利用 59個 SSR 標記對豌豆的 19 個形態性狀進行關聯分析，結果顯示 SSR 位點間有較高的多態性和一定程度的連鎖不平衡，一共檢測出 32 個 SSR 標記位點與 14 個表型性狀相關聯，其中有一些 SSR 標記與兩個或多個形態性狀相關聯。Ehrenreich 等（2007）對來自中歐的 96 份擬南芥種質群體進行分析，并使用 MLM 混合線性模型的關聯作圖方法鑒定出 3 個與分枝變異顯著關聯的位點。Zhang 等（2010）和 Price 等（2010）認為在進行全基因組關聯分析中 MLM 模型比 GLM 模型更適合。賴勇等（2013）對 113 份大麥親本材料進行了 SSR 遺傳多樣性分析及群體遺傳結構分析，結果發現使用 MLM 模型鑒定的顯著關聯位點要明顯比 GLM 模型鑒定的少 3 個，兩種模型分析中分別尋找到了 9 個與株高、穗長、芒長、穗粒數相關聯，6 個與株高、芒長和小穗著生密度相關聯的標記。

本研究中應用 Tassel 2.1 軟件中的GLM 和MLM 兩種模型分析方法進行野生毛花獼猴桃 AsA含量的關聯分析，分別找到了 7 個和 6 個與果實、葉片相關的標記，其中 MLM 分析檢測到的 5 個 SSR標記同樣也在 GLM 分析中所檢測到，標記 751 與葉片的 AsA 含量有關，只有在 MLM 模型分析中檢測到；GLM 模型分析檢測到與葉片的 AsA 含量有關的標記 761，卻在 MLM 模型分析中未檢測到。

MLM 模型分析結果比 GLM 模型分析結果要少 1 個，主要原因是 GLM 分析中只考慮群體結構 Q 值對關聯分析的影響，而 MLM 分析中不僅考慮了 Q 值，還考慮到了親緣關系 K 值對關聯分析的影響，提高了關聯分析的準確性，使結果更加準確可靠。

4、 結論

本研究中解析了野生毛花獼猴桃 AsA 含量關聯位點內各等位變異的表型效應，在 AsA 含量的表型數據和分子標記檢測得到的基因型數據之間用特定的等位變異建立起聯系，發掘了與果實及葉片 AsA 含量關聯的優異標記 SSR 位點 UDK96-040、UDK96-053、UDK97-408、UDK97-414 和 Ke227等。