杏屬（Armeniaca vulgaris Lam.）共有 10 個種，中國有 9 個種，13 個變種，2 000 余個品種和類型（趙鋒 等，2005）?！蠊釉串a于山東省德州市，屬于華北生態群品種，樹勢強健，樹姿半開張，不完全花比率低，成花容易，坐果率高，結果較早，果實品質優良。該品種早熟豐產，耐瘠薄，耐干旱，設施栽培成功率較高（王金政 等，2005），其栽培管理較其他品種簡單，且用途極為廣泛，現已在山東省及黃河流域其它地區廣泛種植，并成為該地區經濟效益較高的杏樹品種（魏敏，2003）。杏在荒山綠化、退耕還林和果樹種植調整中發揮著重要作用（陳學森 等，2001）。杏樹開花早，易遭早春晚霜危害，輕則造成減產，重者甚至絕收（孫仲序 等，2005）。據統計，2001 年山東鄒平因低溫凍害，全縣杏經濟損失 8 000 萬元；同年山東泰安‘大果’和‘凱特’杏受凍均在 90%以上。因此解決杏樹早春晚霜凍害具有重要的意義。

植物的抗寒性是其對低溫寒冷環境的長期適應，由遺傳變異和自然選擇獲得的一種能力（Glerum，1985），是對低溫長期適應的一種遺傳特性。由于木本植物的多年生和木質化構造的特性，對低溫比草本植物有更高的抵抗能力，因此，從木本植物中應該更容易分離到有較強抗寒能力的基因（Welling et al.，2002），這也是改良林果樹種的一個重要方向。

植物 EBP1 與人體內 EBP1 的結構和功能相似性，是近年發現的一種新型蛋白質，被認為是重要的轉錄因子和轉錄共調節因（Yoo et al.，2000）。EBP1 是增殖相關蛋白 2G4（PAZG4s）家族的一員，真核細胞中 PZG4 蛋白高度保守（Zhang et al.，2003），參與多個信號傳導通路，與細胞周期、蛋白質的轉錄翻譯相關，影響細胞的增殖和分化（Zhang et al.，2003；Horvath et al.，2006）。AmEBP1是從沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus Cheng f.）中克?。–ao et al.，2009）的與低溫脅迫相關的基因，該基因是第 1 個被證實能提高轉基因植物抗寒性的核糖體相關蛋白基因，通過促進核糖體的合成以及冷誘導中轉錄因子和下游起保護作用的蛋白的翻譯而起作用。所以 AmEBP1 既對低溫信號的轉導過程有重要作用，也在植物對低溫的長期適應中發揮重要作用?；ǚ酃芡ǖ婪ㄞD化外源基因，操作簡便，已在番茄、番木瓜、蘋果、核桃等果樹上取得成功（牛慶霖 等，2013）。本研究中將沙冬青 AmEBP1 通過花粉管通道法導入‘大果’杏幼胚中，經抗性篩選及分子檢測，在改良 WPM 培養基上培養陽性植株，探討轉基因植株的抗寒性，為下一步抗寒杏新品種選育提供參考。

1、 材料與方法

1.1 試驗材料

將沙冬青 AmEBP1 完整的開放閱讀框用 PCR 方法克隆出來，插入 PBS-T 克隆載體，PCR 方法鑒定與 LacZ 編碼方向一致的中間載體，用 XbaⅠ和 SalⅠ酶切，同時雙酶切載體 pCAMBIA2300（中國科學院遺傳與發育生物學研究所惠贈），用 T4DNA 連接酶，以 6︰1 濃度比，16 ℃鏈接 12 h，獲得表達載體 pCAMBIA2300-AmEBP1，凍融法轉化到大腸桿菌 DH5α 中，卡那霉素篩選陽性菌株，4 ℃下保存備用。授粉試驗于泰安市泰山林業科學研究院試驗基地進行，采集‘凱特’杏花粉 4 ℃保存。

1.2 花粉管導入外源 AmEBP1

采用堿裂解法提取目的 AmEBP1 菌液（Lu et al.，2001）。經純化后的質粒 DNA 溶于 pH 7.6 的TE 緩沖液中，A260/A280比值在 1.9 左右。

于 2012 年 4 月初‘大果’杏花大蕾期人工去除個別花蕾未膨大和未開放的花，對開放的花去雄授‘凱特’杏花粉，3 h 后取 5 μL AmEBP1 DNA 溶液涂抹柱頭 2 ~ 3 次（Tang et al.，2005）。以未轉化的花為對照。于盛花期后 30 d，取幼胚，用 70%酒精、0.1%升汞滅菌，無菌水沖洗 3 ~ 4 次，剝去種皮，接種在改良 WPM 培養基（附加 Kan 50 mg · L-1+ 6-BA 0.8 mg · L-1）上培養，篩選出的芽團用作分子檢測。陽性材料接種到改良培養基（WPM + IBA0.2 mg · L-1）上生根成苗培養用于抗寒試驗。

1.3 轉基因植株的 PCR 檢測

按 CTAB 法提取轉化植株和對照植株基因組 DNA，AmEBP1 質粒 DNA 作為陽性對照：正向引物：5'-ATGTCGGATGATGAAAGGGAGGAGAAGGA-3'；反向引物：5'-TAGGGAAGGGAGGTCAATCTTGAGGTGT-3'。反應體系：反應總體積為 25 μL，包括 2.5 μL 10× Buffer、0.4 mmol · L-1dNTP、2 mmol · L-1MgCl2，1 U Taq DNA polymerase、1 μL 正向引物、1 μL 反向引物、1 μL 模板 DNA（DNA 濃度 10ng · μL-1），ddH2O 加至終體積 25 μL。反應程序：94 ℃，5 min 預變性；94 ℃ 變性 40 s，55 ℃擴增40 s，72 ℃延伸 1 min，35 個循環；最后在 72 ℃延伸 5 min。擴增產物用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 轉基因植株的 Southern 檢測

CTAB 法提取 PCR 陽性的轉基因植株和對照植株 DNA，由北京美萊博醫學科技有限公司進行PCR 標記法 Southern 檢測（牛慶霖 等，2013）。具體方法：XbaⅠ和 SalⅠ雙酶切 AmEBP1 質粒 DNA，DIG-dUTP 標記（地高辛雜交檢測試劑盒），得到 1 200 bp 的片段為標記探針；使用美萊博 DIGD-110“地高辛雜交檢測試劑盒Ⅱ（化學發光法）”（Sambrook et al.，1989）進行洗膜、信號檢測。

1.5 轉基因植株的抗寒能力測定

將 Southern 雜交檢測為陽性的植株與對照，在培養基（改良 WPM + 6-BA 0.8 mg · L-1）上進行芽團擴繁增殖到一定基數，每瓶 4 株，改良培養基（WPM + IBA0.2 mg · L-1）上繼續培養，選擇長勢相近的對照苗進行試驗?？购芰y定參照孫海偉等（2012）的方法并作改進，4 ℃預處理 4 h，然后分別在–4 和–8 ℃冷凍處理 3、6、12、24 和 48 h，每處理 5 瓶。冷凍處理結束后，在 4 ℃，黑暗條件下解凍 3 h，然后 24 ℃光照培養 2 d，統計存活率。將 Southern 檢測為陽性的植株與長勢相近對照苗置于 4 ℃光照培養 24 h，然后置于 0、–4、–8、–12 和–16 ℃各處理 12 h，之后 4 ℃解凍 12 h，每個處理取 5 瓶，每瓶 4 株，采用膜滲透—電解質外滲法（郭衛東 等，2009）測定葉片相對電導率（REC）以表示細胞膜透性，重復 3 次，用 DPS 軟件進行分析、比較。

MDA 的含量測定參照牛慶霖等（2013）的方法。根據測定所得的 REC，應用 EXCEL、DPS 軟件進行非線性回歸分析，參照郭衛東等（2009）的方法，測定轉基因植株的半致死溫度 LT50（Semi lethal temperature）。

2、 結果與分析

2.1 轉 AmEBP1 基因組培杏苗的分子鑒定

2.1.1 PCR 檢測

經花粉管通道法轉化 AmEBP1 基因的‘大果’杏幼胚，在改良 WPM 培養基上由芽團進行多代擴繁。提取嫩葉 DNA 為模板，以載體質粒 DNA 為陽性對照，未轉化的‘大果’杏為陰性對照，進行 PCR 擴增。結果顯示在擴繁的材料中有 6 個轉基因株系 PCR 結果為陽性（圖 2）。

2.1.2 Southern 檢測

將 PCR 擴增結果陽性的 6 個株系轉基因‘大果’杏和對照植株同時采用地高辛標記法進行Southern 檢測，結果表明，未轉基因的對照植株沒有出現雜交帶，轉基因植株中有 5 個株系分別出現 1 ~ 3 條雜交帶，說明 AmEBP1 基因已經通過花粉管通道法整合到這 5 個株系的基因組 DNA 中（圖3）。將陽性株系擴增到一定數量，用于下一步抗寒試驗。

2.2 轉基因株系抗寒能力檢測

對得到的 5 個轉基因陽性株系進行增殖擴繁，接種到改良 WPM + IBA0.2 mg · L-1培養基上繼續培養。選取長勢相近，苗高 8 ~ 10 cm，葉片濃綠，生長健壯的組培苗和對照苗進行抗寒試驗。轉基因植株在–4 ℃下處理 3、6 和 12 h 后，復蘇培養均有較高的存活率（95%、85%和 66.7%），處理12 h 后存活率急劇下降，處理 48 h，解凍復蘇培養后仍有 10.2%的植株存活；對照植株在–4 ℃處理 3 h 后受凍害現象明顯增加，處理 12 h 后基本全部死亡（圖 4）。–8 ℃處理轉基因植株，3 h 后凍害明顯，處理 12 h 后，解凍復蘇培養僅有 16.3%的植株存活（圖 4；圖 5，A6h、A12h），24 h 后基本死亡（圖 5，A24h）；–8 ℃處理未轉基因對照植株 12 h 后（圖 5，B12h），基本不能復蘇。以上結果顯示：–4 和–8 ℃低溫處理下，轉基因植株比未轉基因對照植株的存活率高。

2.3 低溫處理對影片細胞膜透性的影響

如圖 6 可見，隨著處理溫度的降低，植物葉片受傷害程度加重，在–8 ~–16 ℃，轉基因植株葉片相對電導率值一直低于相應的對照，說明轉基因植株受低溫損傷程度較對照較輕；對照 REC 值在–8 ℃時達到峰值，而轉基因植株 REC 在–12 ℃時最大，二者峰值相差 11.2%；低溫處理過程中，植物材料體內 MDA 一直在積累，在–4 ~–16 ℃條件下，對照植株始終高于轉基因植株，說明轉基因‘大果’杏低溫處理下葉片損傷程度比對照輕。

2.4 轉基因植株的半致死溫度

應用電導法測定不同低溫處理的植物組織，在不同溫度下植物組織電解質外滲的累積量總是呈“S”形曲線，Lyons 和 Raison（1970）把低溫對植物細胞膜傷害過程用 Logistic 曲線加以表示，并將曲線的拐點作為低溫半致死溫度。半致死溫度主要反映了溫度、水分與抗寒性之間的數量關系，大量研究表明，植株葉片半致死溫度 LT50的高低可以表示抗寒性的相對大?。ㄉ蚝椴?等，2002）。

本研究表明，轉基因株系的 LT50是–5.80 ℃，未轉基因對照為–3.67 ℃，理論上說明轉基因株系的抗寒能力明顯好于對照植株，這與轉基因植株在抗寒試驗中存活率的結果一致。

3、 討論

溫度是限制植物生長、發育及其地理分布的一個重要因素，低溫造成的凍害對杏及其他果樹和經濟林木威脅很大（Shinozaki & Yamaguchi-Shinozaki，1996；Thomashow，1998）。關于木本植物抗寒基因的研究與草本植物相比較為落后。自費云標等（1994）從沙冬青中分離出了第 1 個來自于木本植物高熱滯活性的 AFP，隨后，Cao 等（2009）采用 cDNA-AFLP 方法，從沙冬青中克隆得到了能提高植物抗寒性的核糖體相關蛋白基因 AmEBP1，并試驗證明 AmEBP1 增強了轉基因植物的抗寒性是通過促進核糖體的合成以及冷誘導中轉錄因子和下游起保護作用的蛋白的翻譯而進行的。隨后沙冬青極強的抗凍能力引起了分子生物學家的極大興趣，利用木本植物分離得到相關抗性基因，再轉化到木本植物，現在已經成為植物抗性育種的新途徑（Song et al.，2013）。近年來，果樹上的轉基因研究日趨深入，果樹大多為雜合體，后代基因易分離，因此利用轉基因手段，將目的基因轉化到受體材料，按無性方式進行繁育，以獲得目標性狀的果樹新品種。1988 年基因轉化首先在核桃（Juglans regia L.）上取得突破，McGranahan 等（1998）獲得了轉 gus 基因核桃再生植株，現已在20 多種果樹上獲得了轉化體或轉化植株。王淑芳等（2001）將膽堿脫氫酶基因成功轉化到番茄中，得到轉基因番茄；王燕霞（2009）利用農桿菌介導法將抗寒轉錄因子 CBF 基因轉入‘嘎拉’蘋果中，PCR 檢測并獲得轉基因陽性株系。中國在櫻桃（Cerasus）、草莓、蘋果等果樹轉基因方面做了許多研究工作，并獲得了轉基因植株，特別是櫻桃的轉抗菌肽基因已由農業部批準進入田間試驗，該項研究處于國際領先水平。本研究中將源于沙冬青的抗寒基因 AmEBP1 轉化到‘大果’杏中，探討其轉化后的抗寒性能，以期解決早春寒冷低溫對凍花、凍果的影響，為抗寒杏品種的選育提供參考。

基因轉化的方法主要有農桿菌介導和外源 DNA 直接導入，花粉管通道法是 DNA 直接導入的一種方式，其方法是將外源基因，通過花粉管進入胚珠，在植物體進行受精的過程中，胚囊內的精細胞與卵細胞均沒有細胞壁，融合形成合子，早期未分化的合子近似于感受態細胞，易于接受外源DNA。方清（2002）將紅樹（Rhhoraa picutota）總 DNA 導入番茄，選育耐鹽番茄；馮莎莎（2007）將 pWBvecloa 質粒 DNA 導入富士蘋果，對轉化植株進行了相關抗性分析；王曉蔓（2009）對影響核桃花粉管通道法轉化因子進行了研究?；ǚ酃芡ǖ婪ㄞD化技術已經在果樹轉基因育種中有所運用，本研究利用花粉管通道法，將沙冬青抗寒基因 AmEBP1 轉化到‘大果’杏中，利用幼胚培養，經卡那霉素篩選，PCR、Southern 檢測得到 5 個轉基因的陽性株系，并將陽性株系在改良 WPM + 6-BA 0.8mg · L-1）培養基上增殖擴繁，在改良 WPM + IBA0.2 mg · L-1培養基上生根成苗，得到轉基因株系，進而對轉基因組培苗的抗寒性能進行了分析。

在木本植物抗寒性測定中應用電導法測定不同低溫處理的植物組織，在不同溫度下植物組織電解質外滲的累積量總是呈“S”形曲線，Lyons 和 Raison（1970）把低溫對植物細胞膜傷害過程用Logistic 曲線加以表示，推導 Logistic 方程的二階導數并令其為零，計算方程的拐點，得到 x = ln a/b，求出各株系相對電導率變化曲線的拐點溫度，拐點溫度就是該株系的 LT50，能較好地反映植物的抗寒力。本研究中轉基因‘大果’杏的 LT50是–5.80 ℃，未轉基因對照 LT50是–3.67 ℃，二者相差2.13 ℃，說明轉基因‘大果’杏的抗寒能力較對照有了明顯提高；抗寒試驗表明，–4 和–8 ℃條件下，轉基因‘大果’杏比對照有較高的存活能力；低溫處理過程中，植物材料體內 MDA 與 REC 含量轉基因‘大果’杏始終低于對照，說明轉基因‘大果’杏低溫處理下葉片損傷程度比對照輕，能夠在相對的低溫環境下生存。

本研究通過花粉管通道法得到 AmEBP1 轉化的幼胚，又將幼胚培養成苗，并對轉化苗的抗寒性能進行了初步分析，得到抗寒性能較好的‘大果’杏轉基因植株，為下一步抗寒杏選育提供了參考。