Flowering Locus C（FLC）是開花抑制基因，編碼 MADS-box 轉錄因子（Michaels & Amasino，1999），廣泛存在于擬南芥、芥菜、甘藍、大白菜和油菜等十字花科作物中。FLC 在轉基因植物中過量表達，會抑制開花。例如油菜 BnFLC 在擬南芥中表達能延遲開花 3 周至 7 個月，擬南芥 AtFLC在油菜中表達能延遲開花 2 周至 6 周（Sanda & Amasino，1996；Tadege et al.，2001）；擬南芥 AtFLC在煙草中表達可延遲開花約 14 d（Hassan et al.，2005）；甘藍 BoFLC3在芥菜中表達可延遲開花約 9d（楊海鵬 等，2013）。目前，利用酵母雙雜、凝膠阻滯和免疫共沉淀等方法對 FLC 抑制開花的分子機理進行了深入研究，發現擬南芥 FLC 基因編碼的蛋白能夠與另一個開花抑制因子 SHORTVEGETATIVE PHASE（SVP）相互作用，并結合到開花信號整合子基因 FT 和 SOC1 的 CArG 基序，抑制 FT 和 SOC1 的表達，從而阻止莖端分生組織向開花轉變（Fujiwara et al.，2008；Li et al.，2008；Jung & Müller，2009）。在芥菜作物中，利用 pET 原核表達系統和酵母真核表達系統也證實了芥菜FLC 家族成員 FLC2能夠與 SVP 蛋白互作（湯青林 等，2011，2012）。
FLC 屬于一個多基因家族。Li 等（2005）以大白菜 BrFLC 的編碼序列制作探針進行 Southern雜交，發現了多條雜交信號，證實了 FLC 基因確實為多基因家族。目前在大白菜中發現有 4 個 FLC家族成員（Schranz et al.，2002；Wu et al.，2012），其中已證實 BrFLC1和 BrFLC2是主要的開花時間和春化反應基因（Yuan et al.，2009；Zhao et al.，2010；Wu et al.，2012）。另外，在油菜中也克隆了 5 個 FLC 家族成員（Tadege et al.，2001），均能抑制開花。此外，Zou 等（2012）從 3 份油菜材料中共獲得了 9 個 FLC 同源基因（4 個來源于 A 基因組，5 個來源于 C 基因組），并得到與開花時間相關的 4 個 QTL。
雖然種子春化作物大白菜、油菜、芥菜和擬南芥 FLC 家族基因已有相關研究，但是典型綠體春化作物甘藍 FLC 家族成員的研究非常少，它們調控開花時間的分子機制也未見深入研究和報道。盡管目前已證實甘藍 FLC3成員能夠與開花抑制因子 SVP 相互作用（楊樸麗 等，2013），但甘藍 FLC家族其他成員是否也可發生類似作用，它們在蛋白作用強度上有何差異，這一作用差異對開花時間又有何影響，目前還未得到確切的分子證據。
本試驗中從甘藍中克隆多個 FLC 同源基因，構建獵物質粒，酵母雙雜交并結合點突變分析 FLC的氨基酸變異對 FLC/SVP 聚合化的影響，為進一步獲得轉基因 FLC 的定點突變體、體內敲除或增補 FLC 家族成員、FLC/SVP 聚合強度的活體鑒定及其開花時間分子調控等奠定基礎。
1、 材料與方法
1.1 材料
甘藍材料‘ZQ-67’為‘早秋–67’母本系，由重慶市蔬菜學重點實驗室提供。酵母雙雜交系統（Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System）、Aureobasidin A（以下簡稱 AbA）、X-a-Gal、YPD、YPDA 及各種酵母缺陷型培養基均購自 Clontech 公司。EcoRⅠ、BamHⅠ和 PstⅠ限制性內切酶購自TaKaRa 公司。pEASY-Blunt Simple Cloning Vector 克隆載體、DNA 回收純化試劑盒、質粒提取試劑盒購自 TransGen 公司。高保真 DNA 聚合酶購自 Invitrogen 公司。高效連接酶購自 ToYoBo 公司。
1.2 BoFLC 家族基因及 BoSVP 的克隆
根據大白菜基因組序列（Wang et al.，2011）、擬南芥 AtFLC（NCBI 登錄號 AY850000）和油菜BnFLC1~ BnFLC5（NCBI 登錄號分別為 AY036888、AY036889、AY036890、AY036891、AY036892）設計甘藍 BoFLC 家族基因（記作 BoFLCy1~ BoFLCy5）的上、下游引物；以擬南芥和白菜 SVP 基因序列（NCBI 登錄號分別為 AF211171、AY356366）設計甘藍 BoSVP 的引物（表 1）。
提取甘藍莖尖 RNA，反轉錄 cDNA 后以此為模板，采用高保真聚合酶 PCR 擴增，分別以 FF\\(E\\)1/FR\\(Ps\\)、FF\\(E\\)2/ FR\\(Ps\\)、FF\\(E\\)3/ FR\\(Ps\\)、FF\\(E\\)4/ FR\\(Ps\\)、FF\\(E\\)5/ FR\\(Ps\\)為引物組合克隆甘藍BoFLCy1、BoFLCy2、BoFLCy3、BoFLCy4、BoFLCy5；以 S\\(E\\)/S\\(B\\)為引物組合克隆甘藍 BoSVP。
為刪除 MIKC 蛋白 BoFLCy1~ BoFLCy5的 MADS 域，重新設計上游引物（表 1）。以 FF\\(E\\)124/FR\\(Ps\\)為引物組合分別從 BoFLCy1、BoFLCy2、BoFLCy4亞克隆 BoFLC▲y1、BoFLC▲y2、BoFLC▲y4；以 FF\\(E\\)35/ FR\\(Ps\\)為引物組合分別從 BoFLCy3、BoFLCy5亞克隆 BoFLC▲y3、BoFLC▲y5。
1.3 酵母重組表達載體構建
將 BoFLCy1~ BoFLCy5、BoFLC▲y1~ BoFLC▲y5質粒經 EcoRⅠ/PstⅠ雙酶切后，連接到酵母載體pGBKT7，分別構建酵母重組質粒 pGBKT7-BoFLCy1~ pGBKT7-BoFLCy5和 pGBKT7-BoFLC▲y1~pGBKT7-BoFLC▲5。將 BoSVP 質粒經 EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切后，連接到酵母載體 pGADT7，構建重組質粒 pGADT7-BoSVP。將 EcoRⅠ/PstⅠ、EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切鑒定為陽性的酵母重組質粒送樣測序。
1.4 酵母感受態制備、轉化及自激活與毒性檢測
參考 Clontech 公司 Gold Yeast Two-Hybrid System 操作手冊，從 YPDA 固體培養基上挑選直徑為 2 ~ 3 mm 的 Y187 和 Y2HGold 酵母單菌落，分別制備酵母感受態細胞。采用醋酸鋰轉化法，將重組質粒pGBKT7-BoFLCy1~ pGBKT7-BoFLCy5和pGBKT7-BoFLC▲y1~ pGBKT7-BoFLC▲y5分別轉入 Y2HGold 感受態細胞；將 pGADT7-BoSVP 轉入 Y187 感受態細胞。
將酵母轉化子 Y2HGold［pGBKT7-BoFLCy1］ ~ Y2HGold［pGBKT7-BoFLCy5］、Y2HGold［pGBKT7- BoFLC▲y1］~ Y2HGold［pGBKT7-BoFLC▲y5］分別涂在 SD/-Trp、SD/-Trp/X-a-Gal、SD/-Leu/-Trp （ 以 下 簡 稱 DDO ） 和 SD/-Trp/X-a-Gal/AbA 固 體 平 板 上 ； 將 轉 化 子 Y187［pGADT7-BoSVP］涂在 SD/-Leu、SD/-Leu/X-a-Gal、SD/-Leu/-Trp 和 SD/-Leu/X-a-Gal/AbA 固體平板上。以空載體轉化子 Y2HGold［pGBKT7］和 Y187［pGADT7］為陰性對照，并以酵母雙雜交系統自帶的 Y2HGold［pGBKT7-Lam］× Y187［pGADT7-T］為陰性對照，Y2HGold［pGBKT7-53］×Y187［pGADT7-T］為陽性對照。30 ℃培養 3 ~ 5 d，進行自激活和毒性檢測。
1.5 酵母雙雜交及其蛋白互作檢測
從酵母菌 Y187、Y2HGold 轉化子中分別挑取單個陽性克隆于 500 μL 2 × YPDA 中混勻，30 ℃培養 20 ~ 24 h，取適量涂于 SD/-Trp、SD/-Leu 和 DDO 固體培養基，30 ℃倒置培養 3 ~ 5 d 至陽性克隆出現。再從DDO固體培養基上挑取陽性克隆分別涂于SD/-Leu/-Trp/AbA（以下簡稱DDO/AbA）、SD/-Ade/-His/-Leu/-Tr（p以下簡稱 QDO）和 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal/AbA（以下簡稱 QDO/X-α-Gal/ AbA）固體培養基，30 ℃培養 3 ~ 5 d 觀察是否有藍色菌落。
1.6 突變體構建及其相互作用
DNAstar 軟件預測 BoFLCy4蛋白的二級結構，并在線（http：//web.expasy.org/protscale/）分析編碼氨基酸的疏（親）水特性，設計點突變引物 14 條（表 1）。利用重疊延伸 PCR 技術共進行 3 輪次PCR（表 2），分別將第 63、120 和 121 位的疏水氨基酸突變為親水氨基酸，將第 77、135 和 157 位親水氨基酸突變為疏水氨基酸，共構建 6 個單突變體和 6 個雙突變體（表 2）。在突變體構建時，先分別將第 1、2 輪次的 PCR 產物電泳，回收目的條帶；再等量混合使其互為模板及引物，加入 dNTP 及Pfu 酶在 PCR 儀上擴增 10 個循環；并以此次的產物作為第 3 輪次 PCR 的模板，克隆突變體并測序驗證，連接到酵母載體 pGBKT7 后轉化酵母菌 Y2HGold，與 BoSVP 酵母雙雜交。
1.7 β–半乳糖苷酶活性測定
采用 Thermo 公司 Yeast β-Galactosidase Assay Kit 試劑盒，按照其操作方法測定酵母融合菌的OD660值和 A420吸光值，每樣品重復測 3 次，取平均值，計算 β–半乳糖苷酶活性。β–半乳糖苷酶活性 =（1 000 ×A420）（/t × V × OD660）。t 為反應時間（min），V 為用作檢測活性的菌懸液體積（mL），活性單位表示為‘Miller Units’（湯青林 等，2013）。
2、 結果與分析
2.1 BoFLC 家族基因克隆及氨基酸序列分析
克隆的甘藍 BoFLCy1~ BoFLCy5基因分別為 607、607、604、607 和 604 bp，均含完整編碼區（NCBI登錄號 KF797913 ~ KF797917）。Blast 在線分析表明：BoFLCy1、BoFLCy2、BoFLCy4基因序列之間有 6 個（cDNA 序列的 5′ 端 2 個，中部 1 個，3端 3 個）堿基差異，它們與油菜 BnFLC3（登錄號AY036980）同源性高達 98%。而 BoFLCy3與 BoFLCy5基因序列之間有 5 個（cDNA 序列 5′ 端 4 個，3′ 端 1 個）堿基差異，它們與油菜 BnFLC4（登錄號 AY036981）同源性高達 99%。這表明已克隆到甘藍 FLC 同源基因。為準確分析 BoFLCy1~ BoFLCy5（含起始密碼 ATG 之前的 9 個堿基）融入酵母載體后的作用差異，將該非編碼區也翻譯成了 3 個氨基酸（圖 1，★所示）。
結構域分析表明（圖 1）：BoFLCy1~ BoFLCy5均屬 MIKC 型蛋白，含 M、I、K 和 C 域。M 域完全相同，均含 50 個氨基酸。但 BoFLCy1、BoFLCy2、BoFLCy4的 IKC域與 BoFLCy3、BoFLCy5存在差異。BoFLCy1、BoFLCy2與 BoFLCy4的 I、K 和 C 域均分別為 25、81 和 33 個氨基酸；而 BoFLCy3與 BoFLCy5的 I、K 和 C 域則分別為 19、87 和 32 個氨基酸。
BoFLCy1、BoFLCy2與BoFLCy4蛋白I域完全相同；但K域在第151位氨基酸上存在差異，BoFLCy1為纈氨酸 V，而 BoFLCy2和 BoFLCy4均為谷氨酸 E。另外，BoFLCy1與 BoFLCy2蛋白 C 域末端有 1個位點不同，前者為酪氨酸 Y，后者為天冬酰胺 N；BoFLCy1與 BoFLCy4的 C 域也有 1 個位點不同，前者為脯氨酸 P，后者為精氨酸 R（圖 1，● 所示）。此外，BoFLCy3與 BoFLCy5蛋白的 I 域、K 域均完全相同，但 C 端域存在 1 個位點差異：前者為脯氨酸 P，后者為精氨酸 R（圖 1，● 所示）。
信號肽預測表明：BoFLCy1~ BoFLCy5蛋白的 N 端均不含信號肽，不屬于胞外分泌蛋白或膜蛋白，在酵母雙雜交檢測蛋白相互作用時，不會受到信號肽的干擾。
2.2 BoFLC 家族蛋白的進化樹分析
為進一步分析甘藍 FLC 家族蛋白 BoFLCy1~ BoFLCy5的進化關系，從 NCBI 中搜索了油菜、大白菜等十字花科作物 FLC 家族蛋白的氨基酸序列，以 Clustalx2 軟件進行比對，并通過 MEGA5 構建系統進化樹（圖 2）。本試驗中所獲得的 BoFLCy3、BoFLCy5蛋白與油菜 BnFLC4（登錄號 AY036891）親緣關系最近。
BoFLCy1、BoFLCy2、BoFLCy4蛋白與油菜 BnFLC3（登錄號 AY036890）、大白菜 BrFLC3（登錄號 ADA70732）、甘藍 BoFLC3（登錄號 AM231518）親緣關系最近。根據 FLC 同源蛋白的進化關系，可將其分成兩類：甘藍 BoFLCy3、BoFLCy5屬于第Ⅰ類；甘藍 BoFLCy1、BoFLCy2、BoFLCy4屬于第Ⅱ類。第Ⅰ類與第Ⅱ類之間的親緣關系較遠（圖 2）。
2.3 酵母重組表達質粒構建與鑒定
將甘藍 BoFLCy1~ BoFLCy5分別構建到 pGBKT7，獲得的獵物質粒 pGBKT7-BoFLCy1~pGBKT7-BoFLCy5分別經 PCR 檢測、EcoRⅠ/PstⅠ雙酶切鑒定（圖 3，A）及測序表明：目的基因的核苷酸序列、插入載體位置與方向均完全正確，且無移碼突變。重組質粒 pGBKT7-BoFLCy1~pGBKT7-BoFLCy5分別轉化 Y2HGold 后，能在 SD/-Trp/X-α-Gal 平板長出白色菌落，且與對照Y2HGold［pGBKT7］菌落大小相當。但是在 SD/-Trp/X-α-Gal/AbA 上不能生長，也不能在 SD/-Leu/-Trp上生長。說明 BoFLCy1~ BoFLCy5無自激活和毒性。
甘藍 BoSVP 與酵母質粒 pGADT7 重組融合成 pGADT7-BoSVP，經過 PCR 檢測、EcoRⅠ/ BamHⅠ雙酶切鑒定（圖 3，A）及測序，表明該酵母融合載體也構建正確。pGADT7-BoSVP 轉化酵母菌 Y187后能在 SD/-Leu/X-α-Gal 平板上長出白色菌落，與對照 Y187［pGADT7］菌落大小相當。但在SD/-Leu/X-α-Gal/AbA 和 SD/-Leu/-Trp 上均不能生長，也無自激活和毒性現象。
此外，刪掉 BoFLCy1~ BoFLCy5的 MADS 域，獲得含 IKC 域的截短體 BoFLC▲y1~ BoFLCy▲5，分別構建酵母重組質粒 pGBKT7-BoFLC▲y1~ pGBKT7-BoFLC▲5，并經過 EcoRⅠ/ PstⅠ雙酶切（圖 3，B）及測序驗證后，轉化酵母菌 Y2HGold、Y187，也無毒性和自激活現象。
2.4 BoFLC 家族蛋白與 BoSVP 相互作用
圖 4 表明：除了陽性對照（P）能夠在 QDO/X-α-Gal/ AbA 平板長出藍色菌落外，所有陰性對照（N、F1 ~ F5、MF1 ~ MF5）均不能生長，表明本酵母雙雜交系統嚴謹可靠。Y2HGold［pGBKT7-BoFLCy1］~ Y2HGold［pGBKT7-BoFLCy3］、Y2HGold［pGBKT7-BoFLCy5］分別與 Y187［pGADT7-BoSVP］融合后，涂布在 DDO 平板上長出白色菌落，能形成二倍體酵母菌。
融合菌依次經 DDO/AbA、QDO 平板篩選后，涂布在 QDO/X-α-Gal/AbA 平板，長出了藍色菌落，表明同時激活了酵母的報告基因 HIS3、AUR1-C、ADE2 和 MEL1，證明 BoFLCy1~ BoFLCy3、BoFLCy5能夠與 BoSVP 相互作用（圖 4，H1、H2、H3 和 H5）。但是，Y2HGold［pGBKT7-BoFLCy4］與 Y187［pGADT7-BoSVP］融合后不能在 QDO/X-α-Gal/AbA 平板上生長（圖 4，H4），說明構建到酵母載體上的 BoFLCy4融合子（含起始密碼之前的 3 個氨基酸 TET）不能與 BoSVP 相互作用。
刪除 M 域、僅保留 IKC 域的截短體 BoFLC▲y1~ BoFLC▲y5與 BoSVP 酵母雙雜交表明：Y2HGold［pGBKT7-BoFLC▲y1］~ Y2HGold［pGBKT7-BoFLC▲y5］與 Y187［pGADT7-BoSVP］均可融合，并能在 QDO/X-α-Gal/AbA 上長藍色菌落（圖 4，MH1 ~ MH5），激活酵母 4 個報告基因 HIS3、AUR1-C、ADE2 和 MEL1。說明去掉 M 域的 BoFLC▲y1~ BoFLC▲y5均能與 BoSVP 相互作用。
BoFLCy4氨基酸序列與BoFLCy1、BoFLCy2高度相似，其M域完全相同。但融入酵母載體pGBKT7后，緊鄰起始密碼子的 9 個非編碼堿基也翻譯成了 3 個氨基酸，為 TET（圖 1，★ 所示），使得 BoFLCy4融合子（BoFLCy4蛋白的 N 端插入 TET）不能與 BoSVP 相互作用，但 BoFLCy1、BoFLCy2以及截短體 BoFLC▲y1、BoFLC▲y2、BoFLC▲y4均可與 BoSVP 相互作用。由此推測：BoFLCy4蛋白較為敏感，當 N 端插入 3 個氨基酸 TET 后阻止了它與 BoSVP 的聚合。
綜上所述，甘藍的 BoFLC 家族蛋白均可與 BoSVP 相互作用。
2.5 BoFLC 變異位點對 FLC/SVP 聚合化的影響
BoFLC▲y1~ BoFLC▲y5對 FLC/SVP 聚合強度存在顯著差異（表 3）：BoFLCy1> BoFLCy2>BoFLCy3> BoFLCy5> BoFLCy4。第Ⅱ類蛋白 BoFLC▲y1、BoFLC▲y2和 BoFLC▲y4平均聚合強度（β–半乳糖苷酶平均活性為 11.7）高于Ⅰ第類 BoFLC▲y3、BoFLC▲y5的平均強度（酶活為 4.2）。但是，作用最強的 BoFLC▲y1（酶活性為 23.16）和最弱的 BoFLC▲y4（酶活性為 1.49）均出現在第Ⅱ類。
在第Ⅰ類中，BoFLC▲y3蛋白第 196 位的疏水性脯氨酸 P 變異為親水性精氨酸 R 后（位于 C 端域），即為 BoFLC▲y5，其作用強度會顯著減弱（酶活性由 5.05 變為 3.35），降為 66.34%。在第Ⅱ類中，作用強度為：BoFLC▲y1> BoFLC▲y2> BoFLC▲y4。當 BoFLC▲y1第 151、200 位氨基酸同時變異（即 BoFLC▲y1V151E和 BoFLC▲y1Y200N），則為 BoFLC▲y2，作用強度（酶活性）由 23.16降為 10.45，降到 45.12%。當 BoFLC▲y2第 197、200 位同時變異（即 BoFLC▲y2P151R和 BoFLC▲y2N200Y），則為 BoFLC▲y4，作用強度（酶活性）降為 12.26%。當 BoFLC▲y1第 151、197 位同時變異（即BoFLC▲y1V151E和 BoFLC▲y1P197R），則為 BoFLC▲y4，作用強度（酶活性）急劇減弱，降為 6.43%。
以上第Ⅰ、Ⅱ類 FLC 家族蛋白第 151、196、197 和 200 位點的疏水氨基酸變異為親水氨基酸后，均會明顯減弱 FLC 與 SVP 的作用，說明該變異位點為疏水氨基酸有利于 FLC/SVP 聚合。
2.6 BoFLC 保守位點突變對 FLC/SVP 聚合化的影響
為進一步研究 FLC 保守位點的疏水氨基酸是否也對 FLC/SVP 聚合化有影響，選擇甘藍 FLC 家族中作用最為敏感且強度最弱的 BoFLCy4，根據蛋白疏水特性和圖譜的波谷或波峰，在 IK 域內各篩選了 3 個親（疏）水氨基酸位點進行突變研究（圖 5）。這些位點在甘藍、芥菜、白菜、擬南芥等FLC 家族蛋白中高度保守，屬于非變異性位點。其中第 77（I 域內，組氨酸 H）、135 和 157 位（K域內，精氨酸 R 和賴氨酸 K）為親水位點，分別突變為苯丙氨酸 F、亮氨酸 L 和纈氨酸 V。而第 63（I 域內，甘氨酸 G）、120 和 121 位（K 域內，亮氨酸 L 和纈氨酸 V）為疏水位點，分別突變為天冬氨酸 D、賴氨酸 K 和谷氨酸 E（圖 5）。
BoFLCy4的 K 域有 3 個 α 螺旋和 1 個 β 折疊（圖 6），其中第 1 和第 3 個 α 螺旋分別延伸到 I域和 C 域。突變位點 120、121、135、157 均位于 K 域的第 3 個 α 螺旋中（在 K 域內）。此外，該蛋白的 I 域有 2 個 β 折疊，突變位點 63 位于 I 域的第 1 個 β 折疊中，而突變位點 77 位于第 1 個 α螺旋的延伸區域（在 I 域內）。以上位點突變后均不會破壞蛋白的 α 螺旋和 β 折疊。
先以 BoFLCy4作為起始模板，FF\\(E\\)124/ FR\\(Ps\\)為引物亞克隆截短體 BoFLC▲y4。再以 BoFLC▲y4為模板，63-L/FR\\(Ps\\)為引物進一步亞克隆，記作 BoFLC▼y4或 BoFLC▼y4WT（與之前的截短體BoFLC▲y4相區別）。并在 BoFLC▼y4基礎之上將疏水位點（第 63、120、121 位）或者親水位點（第77、135、157 位）分別單突變和雙突變，共構建 12 個突變體（表 2），與 BoSVP 酵母雜交并測定β–半乳糖苷酶活性。
與 BoFLC▼y4WT× BoSVPWT酵母雙雜交組合（酶活性為 1.49）相比，發生在 I 域的 2 個單突變體 BoFLC▼y4H77F、BoFLC▼y4G63D中，不論第 77 位親水 His 突變為疏水 Phe（酶活性為 1.51），還是第 63 位疏水 Gly 突變為親水 Asp（酶活性為 1.41），作用強度均不會發生顯著變化，說明 FLC/SVP聚合強度不由 I 域中該氨基酸的親（疏）水性調節。
在 K 域的 4 個單突變體 BoFLC▼y4R135L、BoFLC▼y4K157V、BoFLC▼y4L120K和 BoFLC▼y4V121E中，第 135 位親水 Arg 突變為疏水 Leu，或者第 157 位親水 Lys 突變為疏水 Val 后，作用強度均增加（酶活性分別為 4.36 和 1.84），但 BoFLC▼y4R135L顯著高于 BoFLC▼y4K157V，而第 120 位疏水 Leu 突變為親水 Lys，或者第 121 位疏水 Val 突變為 Glu 后，均會顯著減弱（酶活性分別為 0.82 和 0.63），說明K 域中該位點的親（疏）水特性能調節 FLC/SVP 聚合化。
在親水氨基酸突變為疏水性的雙突變體 BoFLC▼y4H77F, R135L、BoFLC▼y4H77F, K157V、BoFLC▼y4R135L, K157V中，作用強度均顯著增強（酶活性分別為 4.51、1.80 和 5.73），其中 BoFLC▼y4R135L, K157V最強，該雙突變位點（第 135、157 位）均位于 K 域，然而在疏水氨基酸突變為親水性的 BoFLC▼y4G63D, L120K、BoFLC▼y4G63D, V121E和 BoFLC▼y4L120K, V121E中作用強度均顯著減弱（酶活性分別為 0.78、0.52 和 0.15），但 BoFLC▼y4L120K, V121E最弱，該雙突變位點（第 120、121 位）也位于 K 域，說明 K 域親（疏）水特性對調節 FLC/SVP 聚合強度有較大貢獻。
3、 討論
3.1 FLC 基因在蕓薹屬作物中有多個家族成員
Tadege 等（2001）以擬南芥開花抑制基因 AtFLC 為探針，從油菜 cDNA 文庫中克隆了 5 個 FLC基因，發現油菜（為 AACC 基因組）的 FLC 基因為多基因家族，其編碼蛋白 N 端具有高度保守的MADS 域，將油菜 5 個 FLC 基因轉入擬南芥后均可延遲開花時間。本研究中從甘藍中也克隆了 5個 FLC 基因，且編碼 5 個不同的蛋白，并根據分子進化分成了 2 類，不同類的家族成員之間相差 1個氨基酸，說明甘藍（為 CC 基因組）的 FLC 也為多基因家族。本實驗室在芥菜（為 AABB 基因組）中也克隆到了 5 個不同的 FLC 基因，也編碼不同的蛋白，說明芥菜 FLC 也為多基因家族。另外，在 AA 基因組代表作物大白菜中，只發現了 4 個 FLC 家族基因，而在擬南芥中 FLC 僅有 1 個拷貝（Schranz et al.，2002；Wu et al.，2012）。由此表明：在十字花科植物中，擬南芥屬的擬南芥 FLC為單基因；而蕓薹屬作物油菜、甘藍、芥菜、大白菜的 FLC 為多基因家族，但即便均為蕓薹屬，基因組類型不同其 FLC 家族成員的數量也并不完全相同。FLC 家族成員的數量和功能是否與 AA（白菜）、BB（黑芥）、CC（甘藍）、AABB（芥菜）、AACC（油菜）等基因組的不同類型有關，還有待深入研究。另外，本實驗室楊海鵬等（2013）將甘藍 FLC 家族成員之一的 BoFLC3轉入芥菜后，能延遲開花，說明至少 BoFLC3可調節開花時間。本試驗克隆的 5 個 BoFLC 成員中，有 3 個（BoFLCy1、BoFLCy2和 BoFLCy4）與 BoFLC3的編碼氨基酸在分子進化上同屬第Ⅱ類（圖 2），推測這 3 個成員也能夠調節開花時間，但調節強度可能存在差異。而另 2 個成員 BoFLCy3和 BoFLCy5是否具有類似的功能，還缺乏分子證據。因此，要正確理解 BoFLC 家族成員功能的協同性和差異性，還需進行植物體內蛋白相互作用及其轉基因功能驗證。
3.2 FLC 蛋白疏水氨基酸位點變異影響 FLC/SVP 聚合
擬南芥單拷貝的 FLC 基因能抑制開花時間，其編碼蛋白能夠與開花抑制因子 SVP 形成蛋白聚合體（Li et al.，2008）。本研究中甘藍 5 個 FLC 基因的編碼蛋白也均能夠與 SVP 結合成蛋白復合體，激活酵母報告基因 HIS3、AUR1-C、ADE2 和 MEL1，但其作用強度存在明顯差異。FLC 蛋白的K 域內氨基酸的變異位點和保守位點均對作用強度有影響，其中疏水氨基酸可增加相互作用。Yang等（2003）在對擬南芥 AP3/PI 二聚化的研究發現，K 域的疏水氨基酸非常重要，能夠控制 AP3/PI互作強度。這與本研究結果相似：甘藍 FLC 蛋白第 135、157 位（K 域內）突變為疏水氨基酸后能促進 FLC/SVP 聚合；但第 120、121 位（K 域內）突變為親水氨基酸后作用明顯減弱。說明疏水氨基酸確實能夠調節蛋白作用強度。另外，Yang 和 Jack（2004）對擬南芥 PI/SEP3 或 PI/SEP1 蛋白復合體研究發現，盡管 K 域保守的疏水氨基酸能增強該蛋白互作，但主要位于 K 域的第 1 和第 2 個 α螺旋內，K 域內第 3 個 α 螺旋中的疏水氨基酸不能調節該作用強度。而本研究結果與此并不完全相同，甘藍 FLC 蛋白 K 域第 3 個 α 螺旋中的疏水氨基酸能夠增強 FLC/SVP 二聚化。但是在 I 域中的第 63、77 位氨基酸親（疏）水特性不會明顯改變 FLC/SVP 聚合強度。說明甘藍 FLC/SVP 聚合機制與擬南芥 PI/SEP3 或 PI/SEP1 存在差異，推測導致這一差異的原因可能是與蛋白空間構象及其相互作用區域有關。另外，影響 FLC/SVP 聚合強度的這些疏水氨基酸位點是否會改變甘藍植株的花器官表型，它們對開花時間的影響究竟如何，還有待將這些突變體進行轉基因功能驗證。
