同化激素\\(ASs\\)是由動植物產生或人工合成的一類促進細胞生長與分化、擴增肌肉的微量化學物質。同化激素主要分為甾體和1,2-二苯乙烯兩大類,包括雌雄激素、孕激素和糖皮質激素,其在畜牧養殖業和近海海產品養殖中大量使用以提高經濟效益,造成了動物體內不同程度的激素殘留,導致人體機體代謝紊亂、發育異?；驖撛谥禄掳╋L險[1]。
目前很多國家或組織已經立法限制或禁止在食用性動物飼養中使用同化激素。精確先進的激素測定方法是實現激素殘留有效監督的重要手段。動物源食品中激素的測定方法主要有氣相色譜-質譜法\\(GC-MS\\)[2-4]和液相色譜-串聯質譜法\\(LC-MS/MS\\)[5-7]等。
GC-MS需要衍生化,耗時耗力;高效液相色譜法\\(HPLC\\)主要因基質影響大已不常用;高效液相色譜-串聯質譜法\\(HPLC-MS/MS\\)集高效分離和多組分定性、定量于一體,靈敏度高,已成為測定各種復雜基質中多種同化激素殘留的主要方法。同化激素與其它獸藥不同之處在于其具有很強的脂溶性,這使得樣品的凈化極為關鍵,因此有效的凈化手段是實現激素準確靈敏分析的重要前提。
近年來關于不同基質中激素殘留測定的研究越來越多,而目前國內外有關動物源食品中激素殘留測定的綜述并不多見[8-10],國內現有的綜述亦針對性不強[11-13]
,僅列舉了激素測定的各種方法,沒有針對高效液相色譜-串聯質譜法作深入詳細的論述,因此有必要對近些年國內外相關的研究做適當總結,以有助于研究者更好地了解激素殘留測定的最新方法和研究動態。本文重點綜述了動物源食品中同化激素的前處理方法和液相色譜-質譜檢測技術,以期為研究者提供參考。
1 樣品的提取與凈化
1.1結合態分析物的水解
動物源食品中同化激素以游離態和結合態兩種形式存在,要檢測結合態或激素總量時需首先對樣品進行水解以釋放激素。常用的水解方法有酶水解和堿水解。堿水解通常使用氫氧化鈉溶液;酶水解一般是在樣品中加入一定體積的β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶液或枯草桿菌蛋白酶,然后置于溫水浴中水解16h左右。目前酶解這一步存在爭議,已有研究表明,動物肌肉中結合態的同化激素比例很低[14],Hartmann等[15]比較肉類樣品酶水解效率時發現孵育對激素的提取量無影響;Yang等[6]發現肌肉、蝦和牛奶中的內源性激素在無酶解和酶解條件下結果幾乎無差異,因此很多研究省略了酶解步驟。
1.2提取
激素類藥物極性較弱,常用的提取溶劑有甲醇、乙醚、叔丁基甲醚、乙酸乙酯和乙腈等。國家標準GB/T21981-2008中[16]以甲醇為提取溶劑,但甲醇提取液的雜質較多,不易凈化。孫漢文等[17]比較了乙腈、甲醇和叔丁基甲醚等不同溶劑對牛肉中9種類固醇激素的提取效果,結果發現:若用甲醇萃取,較多的脂肪萃取物易導致堵塞固相萃取柱;叔丁基甲醚提取效果最好。
Seo等[3]以甲醇-水為提取溶劑,根據脂肪\\(凝固點小于40℃\\)和激素在冷凍甲醇\\(-98℃\\)中的凝固點不同的原理,在冷的甲醇溶劑中于小于4℃的溫度下冷凍離心去脂。
1.3凈化
激素類藥物受基質干擾嚴重,有效凈化是測定的關鍵。一些較為特別的方法,如加速溶劑萃取\\(ASE\\)[18]、超臨界流體萃取\\(SFE\\)[19]、免疫親和色譜\\(IAC\\)[20]
、固相微萃取\\(SPME\\)[21]和分子印跡技術\\(MIPs\\)[22]等在激素殘留中均得到了應用。盧杰等[23]將亞臨界1,1,1,2-四氟乙烷\\(R134a\\)的萃取技術應用于魚肉中激素殘留的前處理,整個亞臨界萃取過程只需1h,有機溶劑用量僅為傳統方法的十分之一,較傳統的溶劑萃取法萃取效率高、操作簡便、能同時完成萃取和分離、縮短了操作時間,且無環境污染。
雖然這些方法比較先進,但不適于常規大批量檢測?；|固相分散\\(MSPD\\)對生物組織樣品的處理較有效,但研磨的粒度大小和填裝技術的差別可能會使淋洗曲線有所差異,方法不易標準化;IAC是目前凈化和富集效能最強的前處理技術,但尚需進一步探索;SFE速度快、效率高、幾乎不消耗溶劑,但裝置價格昂貴;SPME纖維頭易損壞,費用高。
目前應用較多的凈化方法主要還是固相萃取、凝膠滲透色譜凈化、基質固相分散和冷凍離心去脂等一種或多種方法的結合。
1.3.1固相萃取
很多文獻報道采用C18小柱凈化動物肌肉組織的基質提取液,HLB柱因具有較大的吸附容量和較寬的吸附范圍已經基本取代了C18柱。
HLB柱也存在缺點:在處理大黃魚、鰻鱺和動物肝腎等高脂肪含量的樣品時易發生乳化現象,影響凈化[24]。硅膠柱對于脂肪含量高的樣品中弱極性化合物的凈化效果比較好,在除脂的同時又能保證目標化合物的回收。
李向軍等[24]采用硅膠柱對水產品中24種性激素進行了凈化;康海寧等[25]利用硅膠柱對脂肪含量高、基質較肌肉樣品復雜的動物肝腎樣品進行了凈化。
混合型強陽離子交換柱具有反相和陽離子交換功能,對于弱酸性質的激素具有較好的凈化效果。蔡勤仁等[26]利用混合型強陽離子交換\\(MCX\\)柱凈化豬組織樣品,分析了12種類固醇激素。
1.3.2凝膠滲透色譜
采用激素的常規提取方式,目標物提取效率低、脂肪基質凈化困難且步驟繁瑣,凝膠滲透色譜基于分子大小原理可有效去除油脂和天然色素。研究者將用于農殘凈化的凝膠滲透色譜技術應用到獸藥殘留中,實現了同化激素與雜質的良好分離。孫漢文等[17]將樣品用10mL乙酸乙酯-環己烷溶解后進凝膠滲透色譜\\(GPC\\)凈化,于波長254nm處收集7.5~16.0min的餾分,再過HLB柱進一步凈化,凈化效果良好;謝維平等[27]將提取后的樣品進入自制的LH-20凝膠色譜柱,以乙酸乙酯-甲醇-乙酸為流動相,收集20~35min的洗脫液進行凈化。
GPC應用的關鍵是通過GPC色譜圖找出恰當的切割時間點。由于GPC凈化過程一般耗時長,因此較適用于多種同化激素的同時凈化。
1.3.3基質固相分散
固相分散\\(SPD\\)和多重機制雜質吸附萃取凈化技術\\(MAS\\)主要通過多種功能化吸附材料,將樣品中可能存在的磷脂、脂肪和蛋白質等主要干擾雜質有效去除,同時又不吸附待測物質,可達到樣品凈化和富集的目的。該方法的優勢在于快速、簡便、對研究者的操作技能要求低,因而得到青睞。
MAS的關鍵是根據基質種類和待測物質的性質來選擇合適種類和配比的吸附劑。所用的吸附劑主要包括N-丙基乙二胺吸附劑\\(PSA\\)、十八烷基鍵合硅膠吸附劑\\(C18-封端\\)、石墨化碳黑吸附劑\\(GCB\\)、中性氧化鋁、氨基功能化納米吸附劑等。
PSA可去除提取液中的脂類和糖類物質,但對酸性化合物有一定的吸附作用;C18吸附劑可去除脂肪和非極性化合物,對極性較小的物質有一定的吸附;氨基功能化納米吸附劑可有效吸附樣品中的酸性化合物,去除脂肪酸、磷脂等干擾物質。
GCB可去除提取液中的色素,但對帶有苯環官能團的化合物有較強的吸附作用。王美玲等[28]研究發現,GCB對激素類物質具有較大的吸附作用,通過在提取液乙腈中加入甲酸\\(0.1+99.9\\)溶液可減少PSA對酸性激素的吸附損失,C18吸附劑對激素的吸附不大,因此選擇了一定比例的PSA、C18和硫酸鎂為混合吸附劑,效果較好。姚姍姍等[29]在2mL溶液中加入0.1gC18、0.2g中性氧化鋁和0.1g氨基功能化納米吸附劑有效凈化了魚肉組織中11種同化激素,雜質信號下降至95%以上;張毅等[30]通過試驗確定了以400mgPSA、50mgC18和600mg無水硫酸鎂為混合吸附劑對谷物飼料中的41種激素進行凈化提取,效果較好。趙永綱等[31]利用自制的氨基功能化四氧化三鐵磁性高分子復合微粒\\(EDA-MPs\\)作為基質分散固相萃取吸附劑對牛蛙全血中6種酚類環境激素進行了凈化。
2 樣品的測定方法
2.1液相色譜條件
C18色譜柱應用最多。由于研究者測定的激素種類不同,流動相會有一些差別。高效液相結合質譜測定時,正離子模式一般采用甲酸-甲醇\\(0.1+99.9\\)混合液為流動相;負離子模式下,雌激素中性的甾體結構缺乏酸性或堿性基團,不易離子化,乙腈有利于化合物的去質子化,一般采用乙腈為流動相的有機相,水相則采用純水或者添加一定氨水的水溶液,乙酸銨水溶液則不常用到。王美玲等[28]和張毅等[30]研究發現,水溶液中添加一定量的乙酸銨雖有助于化合物的色譜分離,但卻使多數激素的離子化效率變低。賴世云等[32]以HSST3色譜柱梯度分離雄激素、孕激素、玉米赤霉醇和玉米赤霉酮,用ShieldRP18柱分離雌激素,結合內標法測定了乳及乳制品中的29種性激素。
2.2串聯質譜條件
由于分子結構的差異,雄激素、孕激素采用正離子源,電離形成[M+H]+準分子離子;雌激素采用負離子源,電離形成[M-H]-準分子離子;糖皮質激素類藥物在正、負離子模式下均可電離成多種形式,其中[M+HCOO]-和[M+CH3COO]-準分子離子響應最大。盡管大氣壓化學電離源的響應靈敏度更高,但由于電噴霧離子源更易操作和維護,所以目前大多采用電噴霧離子源\\(ESI\\)測定同化激素。
也有研究采用大氣壓化學電離源\\(APCI\\),如李向軍等[24]采用APCI同時測定了水產品中的24種性激素,以甲醇-水為流動相,雌激素的靈敏度較用ESI源提高了近20倍。
目前激素殘留測定主要采用三重四極桿質譜,需要相應的標準品并建立LC-MS/MS分析方法,可對已知物質進行準確定量分析。而飛行時間和離子肼質譜等具有高分辨率和精確相對分子質量測量的特點,能提供未知化合物的結構信息,應用于激素分析中可精確定性痕量成分,從而擴大分析物種類,應急監測突發事件中的疑似物,是激素檢測技術的發展趨勢。
Touber等[33]利用液相色譜-飛行時間質譜技術測定了牛尿中40種同化激素和β-受體激動劑;蔡勤仁等[26]建立了豬組織中12種類固醇激素的液相色譜-四極桿/線性離子肼串聯質譜\\(LC-Q/Trap-MS\\)結合譜庫檢索法。采用多級反應監測-信息相關采集-增強子離子掃描\\(MRM-IDA-EPI\\)結合標準譜庫檢索的多步模式,將樣品的EPI譜圖與自己已建立的標準EPI譜圖進行匹配,通過匹配值判斷可疑樣品。
12種激素的檢出限為0.2~0.5μg·kg-1,測定下限為0.5~1.5μg·kg-1。
王和興等[34]采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜法\\(UPLC-Q-TOF-MS\\)實現了9種雌激素的快速基線分離和質譜母離子與特征性子離子的精確質量數測定,增強了復雜基質中雌激素的定性能力,檢出限為0.11~0.3μg·kg-1,測定下限為0.37~1.0μg·kg-1。
張峰等[35]首次采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜法\\(UPLC-Q-TOF-MS\\)測定了動物飼料中9種雄激素類藥物。通過碰撞誘導解離模式\\(CID\\)得到各化合物碎片離子的精確質荷比,進一步對各化合物進行定性分析。各化合物的質量精確度均小于5×10-6。測定下限為10~43μg·kg-1,方法的定性準確度高,適用于飼料中禁用雄性激素藥物的測定。
石先哲等[36]構建了在線微柱富集納升液相色譜分析系統,結合納噴離子源串聯質譜法實現腦組織中10種類固醇激素的高靈敏檢測。相同進樣量下,方法的靈敏度比常規尺寸的液相色譜-質譜系統提高了57~714倍。流動相消耗量降低了幾百倍,睪酮的檢出限為20ng·L-1,實際測定中可測出大鼠腦組織中含量為0.06ng·g-1的皮質醇。
3 方法學驗證
3.1基質效應及其消除
基質效應是指色譜分離時基質成分改變了待測組分的離子化效率而引起的信號增強或抑制。
LC-MS/MS普遍存在基質效應,影響測定結果精密度和準確度,尤其對于動物源等基質復雜的樣品?；|效應采用\\(基質匹配標準溶液所作曲線的斜率/無基質標準溶液所作曲線的斜率-1\\)×100%進行評價。負值表示存在基質抑制效應,正值表示存在基質增強效應,絕對值越大則基質效應越強。消除基質效應的方法主要有同位素內標校正和空白基質配制標準曲線。
3.2檢出限和測定下限
3.2.1液相色譜法謝維平等[27]采用凝膠滲透色譜凈化-高效液相色譜法測定了魚肉中的5種激素類藥物,測定下限在10~24μg·kg-1之間;劉宏程等[37]采用基質固相分散-高效液相色譜-紫外檢測法分析了牛奶中的己烯雌酚、己烷雌酚和雙烯雌酚,3種物質的檢出限分別為4.0,4.0,6.0μg·kg-1,測定下限分別為10,10,20μg·kg-1。
3.2.2液相色譜-串聯質譜法高效液相色譜-質譜法\\(HPLC-MS\\)測定激素的測定下限比HPLC降低了10倍以上。Dusi等[38]利用HLB固相萃取小柱結合LC-MS/MS分析了牛肝臟中9種糖皮質激素的含量,檢出限為1.0μg·kg-1;Vanhaecke等[39]利用超高效液相色譜-串聯質譜法\\(UPLC-MS/MS\\)分析了牛肌肉組織中的10種雌激素、10種促孕激素以及14種雄激素,涵蓋了多種天然和人工合成的激素。肌肉樣品微波萃取后用甲醇和正己烷除脂,乙醚液液萃取后過硅膠柱和氨基柱繼續凈化,樣品的檢出限為0.04~0.88μg·kg-1,測定下限為0.12~1.9μg·kg-1。
Yang等[6]測定了肌肉、牛奶和肝臟中50種同化激素,測定下限在0.04~2.0μg·kg-1之間。
HPLC-MS測定激素時,根據基質復雜程度、同時測定激素的種類、降低基質效應的方法以及不同的質譜分析器,測定下限各有不同,有的相差10倍或更多。根據現有文獻,測定下限最低可達0.029μg·kg-1,最高不超過5μg·kg-1。
4 結語
同化激素因為脂溶性強的特點使得基質的凈化非常重要。
HPLC-MS/MS是目前測定同化激素的主要方法,適合于一般的定量檢測。而更先進的質譜分析儀器如高分辨四極桿-飛行時間\\(Q-TOF\\)質譜儀,四極桿離子阱\\(Q-Trap\\)等使得激素的研究朝著未知化合物的定性和結構分析方向發展。
參考文獻:
[1]李俊鎖,邱月明,王超.獸藥殘留分析[M].上海:上?？茖W技術出版社,2002.
