摘要:【目的】有效利用印楝渣廢棄資源研制印楝渣生物藥肥,并探討其對香蕉生長和香蕉枯萎病的影響?!痉椒ā繉⒛退幧谰ń獾矸垩挎邨U菌 HN\ue01111)與印楝渣混合發酵,制備印楝渣生物藥肥;通過抑菌和盆栽試驗,測定印楝渣生物藥肥對香蕉生長的影響以及對香蕉枯萎病的防治效果;采用掃描電鏡觀察其對病原菌菌絲形態結構的影響?!窘Y果】生防菌解淀粉芽孢桿菌 HN\ue01111對香蕉枯萎病菌 Foc4有明顯的抑制作用,抑菌率為 72\ue0101%.生防菌株HN\ue01111與印楝渣具有良好相容性,制備的印楝渣生物藥肥施用量為 5%和 10%時,處理組香蕉的長勢好于對照,鮮質量、干質量、株高和莖粗均有不同程度的提高,與對照差異顯著;施用印楝渣生物藥肥組香蕉的病情指數分別為20和 25,對香蕉枯萎病的防病率分別達到72\ue0102%和77\ue0108%;生防菌 HN\ue01111能降低土壤中病原菌 Foc4孢子數,破壞菌絲形態結構?!窘Y論】印楝渣與生防菌 HN\ue01111發酵腐熟施用可避免對香蕉產生藥害,制成的印楝渣生物藥肥對香蕉的生長具有明顯促進作用,能有效控制香蕉枯萎病的發生。
關鍵詞:印楝渣;生物藥肥;解淀粉芽孢桿菌;香蕉枯萎??;防治效果。
香蕉枯萎病又稱巴拿馬病,是由尖孢鐮刀菌古巴?;?Fusariumoxysporumf.sp.cubense侵染香蕉所引起的毀滅性土傳真菌病害,是全球香蕉生產中危害最嚴重的病害[1\ue0112].目前防治香蕉枯萎病的措施主要有輪作、選育抗病品種、化學防治和生物防治等。但是,香蕉抗病品種育種周期長,短期內難以見效;至今也未研發出特效或高效的化學藥劑,常規殺菌劑防治效果不理想,長期使用還將引起農藥殘留、環境污染、病原菌抗藥性等問題[3\ue0114].生物防治作為一種生態安全的防治措施,在香蕉枯萎病防治中越來越受到重視。
施肥防病是最新發展起來的前沿技術,它改變了傳統的生物防治方法,為香蕉枯萎病的防治提供了一種新的途徑[4\ue0116].生物藥肥具有肥料和殺蟲或殺菌雙重功效,不僅可以有效減輕病蟲害、大幅減少化學農藥的使用,還能解決一些化學農藥難以解決的問題,對有效利用資源、保護生態環境、發展可持續農業具有重要的現實意義。已有報道將生物有機肥與生防菌(如木霉菌、枯草芽胞桿菌、膠質芽胞桿菌和巨大芽胞桿菌等)混合使用可以有效降低香蕉枯萎病的發病率[4,7\ue01111].但大多數研究只是將腐熟的有機肥和生防菌簡單混合使用,鮮見以植物有機物為生防菌培養基質和吸附載體制備生物藥肥的報道。
印楝渣是殺蟲植物印楝 Azadirachtaindica的種仁提取印楝素后的副產品,因其利用率低而被丟棄但印楝渣仍含有少量具有殺蟲、抑菌作用的活性成分,而且還含有大量有機質和微量元素等營養成分以及纖維,可用作生防菌的培養基原料和吸附載體。本研究將耐藥生防菌與印楝渣混合發酵,制備印楝渣生物藥肥,應用到接種香蕉枯萎病菌的土壤中,探討其對香蕉生長和香蕉枯萎病防治的影響,旨在為印楝渣資源化利用以及印楝渣生物藥肥在香蕉枯萎病生物防治的田間應用提供技術支撐和實踐依據。
1 材料與方法
1.1 材料
解淀粉芽孢桿菌 BacillusamyloliquefaciensHN\ue01111從印楝根際土壤中分離并鑒定,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(保藏號CGMCCNO:8421)。香蕉枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌古巴?;?4號生理小種(Fusariumoxysopoyumf.
sp.cubenceRace4,Foc4)由華南農業大學農學院植物病理系姜子德教授提供;攜帶綠色熒光蛋白 GFP標記的尖孢鐮刀菌古巴?;?4號生理小種(Foc4\ue011GFP)由廣東省農業科學院果樹研究所李春雨博士提供。印楝渣為印楝種仁提取印楝素后的副產品,顆粒狀,粒徑為1~2mm.巴西蕉 MusaacuminataAAACavendishcv.Brazil營養杯組培苗由廣東省農業科學院果樹研究所香蕉組培苗中心提供。供試土壤采自華南農業大學農場,砂壤土,有機質、全氮、全磷、全鉀質量分數分別為 20\ue01050、1\ue01012、0\ue01045和 25\ue0104g·kg-1,土壤風干滅菌后備用。
PDA培養基:馬鈴薯 200\ue0100g,蔗糖 20\ue0100g,瓊脂18\ue0100g,蒸餾水 1000mL.NA培養基:蛋白胨 10\ue0100g,牛肉膏 3\ue0100g,氯化鈉 5\ue0100g,瓊脂 15\ue0100g,蒸餾水1000mL.Landy培養基:葡萄糖 20\ue0100g,L-谷氨酸鈉 5\ue0100g,MgSO40\ue0105g,KCl0\ue0105g,KH2PO41\ue0100g,CuSO40\ue01016×10-3g,FeSO40\ue01015×10-3g,MnSO45\ue0100×10-3g,蒸餾水 1000mL.CDM培養基:NaNO33\ue0100g,K2HPO41\ue0100g,MgSO40\ue0105g,KCl0\ue0105g,FeSO40\ue01001g,蔗糖 30\ue0100g,瓊脂 15\ue0100g,蒸餾水 1000mL.液體基礎培養基:KH2PO41\ue0100g,(NH4)2SO45\ue0100g,NaCl0\ue0101g,MgSO4·7H2O0\ue0105g,CaCl20\ue0101g,酵母膏0\ue0102g,蒸餾水 1000mL,pH7\ue0100.印楝渣固體培養基:印楝渣 95%(w),添加麥麩 5%(w)增加通透性。
1.2 生防菌對香蕉枯萎病菌的抑制作用
1.2.1 平板對峙法
在 PDA培養基平板中心位置一側 2cm處接種直徑為 5mm的香蕉枯萎病菌菌餅,在另一側對稱處接種一環經活化的生防菌HN\ue01111,以不接種生防菌為對照,28℃倒置黑暗培養 5d,觀察生防菌 HN\ue01111對病原菌菌絲生長的抑制作用。
1.2.2 抑菌圈法
將生防菌 HN\ue01111在 NA培養基上活化,分別挑取一環接種于含 50mLNA培養基、Landy培養基和 CDM培養基的 250mL三角瓶中,28℃條件下180r·min-1振蕩培養2d.培養液離心后經 0\ue01022μm濾膜過濾,得無菌發酵液。將香蕉枯萎病菌 Foc4在 PDA平板上活化,培養 7d后,用無菌水沖洗菌絲制得 Foc4孢子液;吸取 1mL孢子懸浮液(孢子數為 1×107cfu·mL-1),加入到融化并冷卻到 45℃左右的 PDA培養基中,混勻,倒平板。待培養基凝固后,將牛津杯依次放置于培養基上,取100μL無菌發酵液加入牛津杯中,以無菌水作空白對照。置于 28℃培養 2d,以抑菌圈大小判斷生防菌 HN\ue01111對病原菌 Foc4的抑菌活性。
1.3 生防菌與印楝渣的相容性測定
1.3.1 印楝渣提取液的抑菌作用
取印楝渣 10g,分別加入甲醇、乙酸乙酯和蒸餾水各 10mL,混勻后置于黑暗中浸提 2d,離心取上清液,經 0\ue01022μm無菌過濾器過濾除菌后,根據抑菌圈法測定印楝渣的甲醇、乙酸乙酯和水提取液對解淀粉芽孢桿菌 HN\ue01111生長的影響,以提取溶劑作為對照。以是否產生抑菌圈來判斷其對生防菌是否有抑菌活性。
1.3.2 生防菌的生長測定
挑取解淀粉芽孢桿菌HN\ue01111單菌落接種至 NA液體培養基中,以 180r·min-1于 28℃搖瓶中培養 24h,得種子液。將種子液按 2%體積比接入以印楝渣(8\ue0100g)為唯一碳源的液體基礎培養基中,對照分別以葡萄糖(8\ue0100g)、可溶性淀粉(8\ue0100g)或玉米粉(8\ue0100g)作為唯一碳源;分別置于搖瓶中,180r·min-1,28℃條件下培養。
48h后分別取1mL發酵菌液,測定各組的 D600nm,判斷 HN\ue01111菌株生長能否以印楝渣為唯一碳源。
1.4 抑菌機理
1.4.1 土壤培養法測定抑菌效果
試驗設置 3個處理:添加印楝渣(6\ue0100g),接種香蕉枯萎病菌 Foc4\ue011GFP(5mL);添加生防菌株 HN\ue01111(5mL),接種香蕉枯萎病菌 Foc4\ue011GFP(5mL);對照只接種香蕉枯萎病菌 Foc4\ue011GFP(5mL),不添加印楝渣和生防菌株HN\ue01111.稱取 24\ue0100g滅菌土壤,按照試驗處理分別添加印楝渣或生防菌,然后接種 5mL攜帶綠色熒光蛋白GFP標記的香蕉枯萎病菌 Foc4\ue011GFP(孢子濃度為4×107cfu·mL-1),再加入無菌水 4mL,混勻后置于培養皿中 28℃條件下黑暗培養 2d.每處理分別取1\ue0100g樣品,加入 10mL無菌水,搖勻,吸取 10μL上清液滴于載玻片上,熒光顯微鏡觀察病原菌孢子的萌發情況,拍照,并統計相同放大倍數下 3個不同視野中的孢子數。
1.4.2 生防菌對病原菌菌絲形態結構的影響
處理和對照菌絲取自平板對峙法樣品,挑取離生防菌最近的病原菌菌絲,分別加入 φ為 3%的戊二醛溶液固定24h,用0\ue0101mol·mL-1磷酸緩沖液(pH7\ue0102)漂洗 3次,用 w為1%的鋨酸溶液固定1\ue0105h,磷酸緩沖液再漂洗 3次;用 φ為 30%、50%、75%和 90%的乙醇溶液順序脫水各 1次,每次 10min;然后以 φ為50%、70%、90%和 100%的乙酸異戊酯溶液分別漂洗 2min.將菌絲置于銅網上干燥,離子濺射噴金后,掃描電鏡觀察并采集圖像。
1.5 印楝渣生物藥肥的制備及對香蕉生長和香蕉枯萎病的影響
1.5.1 印楝渣生物藥肥的制備
將生防菌 HN\ue01111種子液按體積比 1%接種量,接入含 2L液體 NA培養基的5L三角瓶中,28℃條件下180r·min-1振蕩培養 2d.將所得發酵液按 150mL·kg-1的量接種到印楝渣固體培養基中,混勻后培成梯形堆體,置于室溫發酵腐熟。發酵過程中,根據需要補充水分,保持濕度 40% ~45%,堆體溫度過高時進行翻堆處理。
發酵至堆體不再產熱結束,適當噴灑 HN\ue01111發酵液使印楝渣生物藥肥中生防菌的含量大于 2×108cfu·g-1.
1.5.2 對香蕉生長的影響 試驗設置 3個處理:添加 5%(w)生物藥肥;添加 10%(w)印楝渣生物藥肥;不添加生物藥肥(對照)。每處理按土質量比將生物藥肥與風干土(10kg)混勻,裝入塑料盆。挑選大小一致香蕉苗(5~6片葉),每盆移栽1株,每5盆1組,每組為 1個重復,共重復 3次。常規澆水管理,60d后調查香蕉苗生長情況,分別測量鮮質量、干質量、株高和莖粗。
1.5.3 對香蕉枯萎病的防治
試驗設置 4個處理:添加 5%(w)印楝渣生物藥肥,接種 Foc4;添加 10%(w)印楝渣生物藥肥,接種 Foc4;不加生物藥肥,接種 Foc4(陽性對照);不加生物藥肥,也不接種 Foc4(空白對照)。每處理按土質量比將生物藥肥與風干土(10kg)混勻,裝入塑料盆。每盆移栽大小一致的香蕉苗(5~6片葉)1株,每 5盆 1組,每組為 1個重復,共重復 3次。待香蕉移栽定植 7d后,除空白對照外,其余處理采用傷根澆入法接種,每盆澆灌 Foc4孢子懸浮液(孢子數為 1×106cfu·mL-1)10mL.常規澆水管理,病原菌接種 30d后調查香蕉苗發病情況,并拍照。
1.6 數據處理試驗所得數據經
Excel2007和 SPSS13\ue0100軟件進行處理及分析。香蕉枯萎病病情分級標準參照張志紅等[8]的方法;病情指數和防病效果的計算參考許志剛[12]的方法:病情指數 =∑(各級發病數 ×該級代表數)/總數 ×最高級代表值 ×100,防病率 =(對照病情指數 -處理病情指數)/對照病情指數 ×100%.