綠僵菌\\( Metarhizium spp． \\) 是一類重要的昆蟲致病真菌，被廣泛應用于農林害蟲防治。土壤是綠僵菌宿存的重要場所，是綠僵菌資源的主要來源渠道，但因土壤中的大量非目標真菌，如黃曲霉\\( Aspergillus flavus\\) 、黑曲霉\\( A． niger\\) 、毛霉\\( Mucor racemosus\\) 等與綠僵菌的生長條件相近，而且生長速度比綠僵菌快，常導致綠僵菌分離過程中大面積污染，影響分離效率。綠僵菌在土壤中的宿存和持續控制害蟲能力等研究中均涉及到從土壤中分離綠僵菌的過程，統計施放綠僵菌后的種群時空動態，需能有效分離但不抑制綠僵菌生長的分離培養基，并能保證分離過程中綠僵菌的生長不受非目標菌的影響。
因為生長條件和營養條件相似，真菌污染在綠僵菌分離過程中較易發生，在分離培養基中添加抗生素是控制綠僵菌污染的有效方式［1］。目前市場上真菌抗生素主要有氨基糖苷類抗生素，如井岡霉素和春雷霉素; 核苷類抗生素，如武夷菌素、多抗霉素、寧南霉素等; 四環素類抗生素，如金霉素和土霉素; 多烯類抗生素，如近年來應用較多的放線菌酮和兩性霉素 B 類; 大環內酯類抗生素，如梧寧霉素; 多醚類抗生素，如莫能菌素［2-3］。
本研究以土壤中 6 種非目標優勢真菌和 2 種綠僵菌為供試菌，評價了 3 種真菌抗生素對目標菌和非目標菌的抑制作用，旨在篩選出對土壤中的優勢真菌有較好抑制效果但不影響綠僵菌生長的抗生素種類和濃度，用于綠僵菌的分離。
1 材料與方法
1． 1 供試藥劑與供試菌株
供試藥劑有伊曲康唑\\( 西安楊森制藥有限公司生產\\) 、兩性霉素\\( Amresco 公司生產\\) 、放線菌酮\\( Sigma公司生產\\) 。供試菌株有金龜子綠僵菌\\( M． anisopliae\\) Ma09 和黃綠綠僵菌\\( M． flavoviride\\) FI985，均由廣東省林業科學研究院提供。
1． 2 土壤非目標真菌的分離與鑒定
土壤采集于廣東省內的苗圃地、桉樹林地和松樹林地，獨立保存帶回實驗室進行分離。在無菌條件下，取5 g 土樣置于容量為100 mL 三角瓶內，加入0． 3%吐溫-80 無菌溶液50 mL，200 rpm 下振蕩20 min，靜置3min 后，再取上層溶液，用無菌水進行連續 4 次 10 倍梯度稀釋，獲得 5 個濃度的菌懸液。取不同濃度的菌懸液 100 μL 均勻涂于薩氏培養基\\( SDAY\\) 平板\\( 直徑為 9 cm\\) ，在\\( 26 ±1\\) ℃下暗培養 3 ～4 d，挑取單菌落點接于無菌的 SDAY 平板進行純化、鑒定。鑒定后轉接于 SDAY 斜面培養基，保存于廣東省林業科學研究院。
1． 3 3 種真菌抗生素對 6 種土壤非目標真菌的抑制效果測定
毛霉、黃曲霉、黑曲霉、青霉\\( Penicillium commune\\) 、擬青霉\\( Paecilomyces fumosa-roseus\\) 、灰霉\\( Botrytis ci-nerea\\) 在土壤內含菌量高、生長速度快，易造成綠僵菌分離時大面積污染，故選為真菌抗生素抑菌效果的測試對象。在 SDAY 培養基添加不同濃度伊曲康唑\\( 5，10，25，50，100，200 μg/mL\\) 、兩性霉素\\( 1，5，10，50，100，200 μg / mL\\) 和放線菌酮\\( 1，5，10，20，50，100 μg / mL\\) ，制成抑菌培養基平板\\( 直徑為 9 cm\\) 。用接種針挑取供試的 6 種真菌孢子\\( 菌絲\\) 點接于抑菌培養基平板中央，每處理 5 重復，\\( 26 ±1\\) ℃暗培養［4］。以不加真菌抗生素的 SDAY 平板作對照\\( CK\\) ，接種后第 3 天起，每 24 h 用十字交叉法測量各菌落直徑，至菌落長滿培養皿。計算 3 種真菌抗生素對各真菌的相對抑制率，將相對抑制率轉換成幾率值\\( Y\\) 、藥劑濃度轉換成以10 為底的對數值\\( lgx\\) ，做線性回歸，得毒力回歸方程\\( Y = algx + b\\) 和相關系數\\( Ｒ\\) ，計算3 種真菌抗生素對供試 6 種土壤非目標真菌生長的有效抑制濃度\\( EC50和 EC90\\) ，結合相對抑制率評價真菌抗生素對 6 種非目標真菌抑制作用的強弱。
相對抑制率 A = \\( B － C\\) /B ×100%
式中，B 為對照組菌落平均直徑\\( mm\\) ，C 為處理組菌落平均直徑\\( mm\\) 。
1． 4 3 種真菌抗生素對綠僵菌生長影響測定
在添加終濃度為 200 μg/mL 的伊曲康唑、100 μg/mL 的兩性霉素和 100 μg/mL 放線菌酮的 SDAY 培養基平板中央，分別點接金龜子綠僵菌 Ma09 和黃綠綠僵菌 FI985 孢子，每處理 5 個重復，\\( 26 ±1\\) ℃暗培養，以不加真菌抗生素的 SDAY 培養基作對照，接種后采用十字交叉法每天測量綠僵菌菌落直徑，按 1． 3 的方法計算相對抑制率，評價 3 種真菌抗生素對綠僵菌生長的影響。
1． 5 數據處理
應用 DPS 和 Excel 軟件進行方差分析、Duncan 新復極差分析和毒力回歸分析。
2 結果與分析
2． 1 真菌抗生素對供試 6 種土壤非目標真菌的抑菌效果分析
2． 1． 1 菌落生長趨勢 不同濃度的伊曲康唑、兩性霉素和放線菌酮對供試的 6 種非目標真菌均有抑制作用，且真菌抗生素濃度越大菌落生長越慢。圖 1 ～ 2 是以黃曲霉、青霉和黑曲霉為例，在不同濃度的伊曲康唑、兩性霉素和放線菌酮作用下的生長變化趨勢。
圖 3 ～4 表明，接種后第 4 天，3 種真菌抗生素對 6 種非目標真菌均有抑制作用，同種抗生素對真菌的相對抑制率隨藥劑濃度的增加而提高。不同真菌抗生素對供試菌的抑菌效果差異明顯，伊曲康唑對黑曲霉和毛霉的抑制效果較差，在濃度為 100 μg/mL 時對其它 4 種真菌均有較好的抑制效果; 兩性霉素對 6 種真菌的抑制效果較一致，對黃曲霉最佳，在濃度為 100μg /mL 時即可完全抑制其生長; 放線菌酮對灰霉和擬青霉有較好抑制效果，在濃度為 50 μg/mL 時即可完全抑制灰霉的生長。
2． 1． 2 相對抑制率分析 伊曲康唑在測試濃度范圍內均不能完全抑制供試菌的生長，對黃曲霉和青霉的抑制率要高于其他幾種供試菌，對青霉的抑制率平均超過 70%; 對黃曲霉的抑制率，除了 5 μg/mL 濃度外，其他濃度達到 70%以上\\( 表 1\\) 。對毛霉和黑曲霉的抑制效果最差，對毛霉最高抑制率為 54． 84%。
兩性霉素濃度為 100 μg/mL 及以上可完全抑制黃曲霉的生長; 濃度為 25 μg/mL 時，對黑曲霉和灰霉抑制率分別為 70． 09%和 73． 73%。兩性霉素對毛霉的抑菌效果比伊曲康唑好，當濃度為 100 μg/mL 時，抑制率為 74． 77%; 當濃度為 200 μg/mL 時對 6 種供試真菌的相對抑制率達到 76%以上。
放線菌酮對灰霉抑菌效果較好，濃度為50 μg / mL 時即可完全抑制灰霉的生長，1μg /mL 也可達到 61． 9% 的抑制率。當濃度達到 50 μg/mL 時對黃曲霉和毛霉的抑制率達到 90%以上，對于擬青霉和青霉也達 70%以上。當濃度為 100 μg/mL 時，對于 6 種供試菌抑菌率均達到 75% 以上，其中毛霉、擬青霉和灰霉均為 100%。
2． 1． 3 毒力回歸分析 3 種抑菌劑對 6 種真菌的毒力回歸分析表明，各回歸方程均能較好的擬合\\( Ｒ ＞ 0． 84\\) \\( 表 2\\) 。抑制濃度\\( EC50，EC90\\) 分析表明，3 種真菌抗生素對供試 6 種真菌的抑制效果差異明顯。伊曲康唑對青霉、擬青霉、灰霉、黑曲霉和黃曲霉有較好的抑制效果，EC50分別為 0． 54，3． 33，3． 96，3． 97，6． 93 μg/mL; 對毛霉的抑制效果較差，EC50達 90． 57 μg/mL。兩性霉素對毛霉的抑制效果比較差，對灰霉抑制效果最好，EC50僅為 3． 23 μg/mL，對另外 4 種真菌的EC50為 9． 48 ～16． 59 μg/mL。放線菌酮對灰霉抑制效果最好，EC50為6． 87 μg/mL，而對于其他5 種真菌抑制效果相當，EC50為 13． 82 ～27． 43 μg/mL。兩性霉素和放線菌酮濃度分別為 35． 28，27． 43 μg/mL 時即對 6 種真菌可達到 50%的相對抑制率。伊曲康唑作用于毛霉和兩性霉素作用于黑曲霉的 EC90都極大，表明 2 種真菌抗生素無論濃度多大，對供試菌都不能百分百抑制。
2． 2 3 種真菌抗生素對綠僵菌生長的影響
接種后第 3，4，5 天，3 種真菌抗生素作用下 2 株綠僵菌菌落直徑間均差異極顯著\\( P ＜0． 01\\) \\( 表 3\\) 。其中放線菌酮作用下的菌落直徑與對照差異不顯著; 兩性霉素作用下除了第 4 天 FI985 菌株的菌落直徑與對照差異不顯著，其他處理均顯著小于對照; 伊曲康唑作用下 2 株綠僵菌接種第 3，4，5 天的菌落直徑均顯著小于對照，結果表明伊曲康唑和兩性霉素對綠僵菌具有一定的抑制作用，且伊曲康唑大于兩性霉素，放線菌酮對綠僵菌的抑制作用不明顯。
3 結論與討論
綜合伊曲康唑、兩性霉素和放線菌酮對灰霉、擬青霉、黃曲霉、黑曲霉、毛霉、青霉的生長抑制效果分析，兩性霉素和放線菌酮均能有效控制 6 種非目標真菌的污染，抑制效果比伊曲康唑好，且以放線菌酮為最優。
伊曲康唑對綠僵菌菌落生長的影響顯著大于兩性霉素和放線菌酮; 放線菌酮作用下的綠僵菌菌落直徑與對照間差異不顯著，當濃度為 27． 43 μg/mL 時對 6 種供試非目標真菌的抑制率即達 50%，濃度為 50 μg/mL時即可抑制絕大部分真菌生長，滿足綠僵菌分離的要求，是綠僵菌分離的首選真菌抗生素，其次是兩性霉素。
伊曲康唑和兩性霉素對綠僵菌有一定的抑制作用，但都不會完全抑制綠僵菌生長，因此可以根據研究目的選擇性使用。在進行綠僵菌土壤宿存動態研究時應選擇對綠僵菌生長影響小的抗生素，以免影響綠僵菌在土壤內的實際數量，而在進行土壤內綠僵菌菌株分離收集時，可根據土壤內雜菌的類型和數量，適量添加相應的抗生素，以減少污染。
參考文獻
［1］ 彭立群，田子珩，張俊琦． 植物組培中污染發生原因及防治技術研究進展［J］． 廣東林業科技，2012，28\\( 1\\) : 82-86．
［2］ 包建中，古德祥． 中國生物防治［M］． 太原: 山西科學技術出版社，1997．
［3］ 劉萍萍，閆艷春． 微生物農藥研究進展［J］． 山東農業科學，2005，7\\( 2\\) : 78-80．
［4］ 李德新，郭鳳根，王仕玉，等． 3 種抑菌劑對蛇足石杉內生真菌黑曲霉的抑制效果研究［J］． 安徽農業科學，2011，39\\( 20\\) : 12106-12107，12110．
