芽孢桿菌\\(Bacillusspp.\\)能夠形成耐熱、耐旱、抗紫外線的芽孢,是研制生防菌劑的良好材料。多種解淀粉芽孢桿菌\\(B.amyloliquefaciens\\)菌株因其具有控制植物病害、促進植物生長、提高作物產量等優勢,在生物防治制劑中顯示出廣闊的應用前景。解淀粉芽孢桿菌B9601-Y2\\(簡稱Y2,專利號:ZL200310104195.6\\)是筆者所在實驗室從小麥根系土壤分離的一株具有廣譜抑菌促生長作用的生防菌株,能有效防治玉米大斑病、小斑病、圓斑病等真菌性病害,促進多種植物插條生根,是一種很好的生物防治制劑,但其制劑較單一,目前僅有可濕性粉劑產品。為克服Y2可濕性粉劑顆粒較大、易于沉降和分散性較差等缺點,筆者篩選并確定了Y2懸浮劑的最佳配方,旨在為其產品的商業化生產提供理論依據。
1、材料與方法
1.1供試材料
供試菌株:解淀粉芽孢桿菌B9601-Y2菌粉,芽孢含量≥1.0×1011cfu/g,芽孢率≥95%;潤濕分散劑:烷基萘磺酸縮聚物鈉鹽\\(MorwetD-425\\)、亞甲基雙萘磺酸鈉\\(NNO\\)、聚乙烯醇\\(PVA\\)、苯乙基酚聚氧乙烯醚\\(農乳602\\)、烷基芳基聚氧乙烯聚氧丙烯醚\\(農乳34\\)、聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯\\(吐溫-80\\)、烷基酚聚氧乙烯醚\\(OP-10\\);增稠劑:黃原膠、硅酸鎂鋁、羧甲基纖維素\\(CMC\\);防凍劑:甘油;防腐劑:苯甲酸鈉、山梨酸鉀、對羥基苯甲酸甲酯;紫外\\(UV\\)保護劑:黃原膠、羧甲基纖維素\\(CMC\\)、剛果紅、淀粉、糊精、尿素、抗壞血酸\\(VC\\)、純牛奶;消泡劑:正辛醇;主要儀器:粉碎機、小型立式砂磨機、旋轉粘度計、激光粒度分析儀、臺式離心機、恒溫搖床等。
1.2制劑加工與初始比例
將Y2菌粉與一定比例助劑補足水混合均勻后經砂磨機砂磨4h后制成各種不同的懸浮劑。初始制劑成分配比\\(質量百分數,下同\\):原粉5.00%、潤濕分散劑總計≤10.00%、紫外保護劑0.30%、防腐劑0.30%、防凍劑5.00%、消泡劑0.20%。
1.3配方的篩選
1\\)潤濕分散劑。采用流點法篩選潤濕分散劑品種,試驗重復4次。選用對供試原粉流點值較低的潤濕分散劑進行下一步試驗,按懸浮劑配制方法,配制幾個樣品,測定樣品懸浮劑的各項指標,確定潤濕分散劑組合及用量。
2\\)增稠劑。按照配方要求,將粘度調節劑按不同的含量制成樣品。將樣品經\\(54±2\\)℃貯存14d后,測定各樣品的傾倒性、流動性及分層情況。
3\\)紫外保護劑。將保護劑按0.30%比例添加到發酵液中,混合均勻并分別稀釋后涂布在LB平板上,置于距離紫外燈40cm處,分別照射30、60、90s后統計存活率。以不加保護劑作對照,每個處理重復4次。保護效能指數=\\(處理芽孢存活率-對照芽孢存活率\\)/\\(100-對照芽孢存活率\\)。
4\\)防腐劑。以上述配方為基礎,加入不同種類和含量的防腐劑,配制不同的樣品。將樣品經室溫貯存14d后,測定產品的懸浮率和霉變程度。
5\\)防凍劑。將篩選出的潤濕分散劑、增稠劑、保護劑、防腐劑配制成懸浮劑樣品后,添加不同濃度的防凍劑。將樣品經\\(0±2\\)℃貯存24h后,測定產品的懸浮率、析水率和分散性。
1.4懸浮劑穩定性的測試
將試驗結果得到的最佳配方制作成懸浮劑樣品,分2組裝入安碚瓶中,每組5瓶,分別進行冷貯[\\(0±2\\)℃貯存7d]和熱貯[\\(54±2\\)℃貯存14d]處理,測定懸浮劑的芽孢含量、懸浮率、流動性、粘度等各項指標。
1.5制劑質量指標的測定
按照《中華人民共和國國家標準》對解淀粉芽孢桿菌Y2懸浮劑的各項質量指標進行測定。懸浮率測定參照GB/T14825-2006的方法;pH值測定參照GB/T1601-1993的方法;冷貯穩定性測定參照GB/T19137-2003的方法;熱貯穩定性測定參照GB/T19136-2003的方法;分散性、傾倒性、持久泡沫量測定參照易敏等的方法;有效成分采用平板菌落計數法測定;粘度采用旋轉粘度計測定;顆粒直徑采用激光粒度儀測定。
1.6數據處理與統計方法
應用SPSS19.0對所得試驗數據進行統計分析,采用Excel2007進行圖表繪制。
2、結果與分析
2.1潤濕分散劑的篩選
1\\)潤濕分散劑的流點。在預試驗助劑與Y2生物相容的基礎上,選擇7種生物相容性較好的潤濕分散劑,用流點法測定各自流點,比較其潤濕分散能力\\(表1\\)。潤濕分散劑流點越小,表明潤濕分散能力越強。
由表1可知,7種潤濕分散劑的流點由小到大依次為農乳34 2\\)潤濕分散劑配方的優化。根據預試驗,樣品中的增稠劑、防腐劑和防凍劑分別為黃原膠、對羥基甲酸甲酯和甘油,添加量分別為0.20%、0.10%和5.00%,配制成不同的樣品后,測定懸浮劑的懸浮率和分散性\\(表2\\)。 由表2可知,5號樣品中潤濕分散劑選用農乳34、D-425以及OP-10組合,其用量分別為2.50%、2.00%和1.50%,樣品的懸浮率最高達96.20%,分散性能優越。 2.2增稠劑的確定 以黃原膠、硅酸鋁鎂及羧甲基纖維素3種增稠劑為篩選對象,按照已篩選出的潤濕分散劑,加入不同含量和比例的增稠劑,配制成不同的樣品后,測定懸浮劑的傾倒性和流動性\\(表3\\)。由表3可知,當樣品中黃原膠的添加量為0.15%時,懸浮劑的傾倒性和流動性均良好,且沒有分層狀況。 2.3紫外保護劑的選擇 測定結果表明,8種紫外保護劑不同照射時間的保護效能表現出差異性\\(表4\\)。照射30s后,各保護劑均有不同程度的保護作用,除糊精和純牛奶保護效能指數低于0.50外,其余均高于0.60,VC保護效率最高0.93;照射60s后,淀粉和VC保護效能急劇下降到0.19和0.11;照射90s后,黃原膠、CMC和尿素3種紫外保護劑仍然保持0.40以上的較高保護效能。 CMC生物相容性較差\\(預試驗\\),黃原膠已選作為增稠劑,若再加入會影響體系的平衡,因此,在黃原膠添加量的基礎上選擇尿素作為保護劑。進一步篩選結果顯示,在0.15%黃原膠的基礎上添加0.15%和0.20%尿素具有較好的保護效果,且無顯著差異\\(表5\\)。綜合分析并考慮成本因素,確定以尿素為懸浮劑的保護劑。 2.4防腐劑的篩選 選擇與Y2生物相容性較好的山梨酸鉀、苯甲酸鈉和對羥基苯甲酸甲酯,按照試驗篩選出的助劑,加入不同的防腐劑,配制成不同的樣品,再將樣品經室溫貯存14d后測定其懸浮率和霉變度\\(表6\\)。測定結果表明,加入0.06%對羥基苯甲酸甲酯防腐效果較好,制劑前后懸浮率未發生顯著變化且無霉變現象;而0.10%~0.30%山梨酸鉀和苯甲酸鈉處理后,制劑的懸浮率下降明顯且仍有霉變。 2.5防凍劑的確定 制作懸浮劑的一些助劑在溫度較低時可從液態凝固成固態。為防止產品在貯存過程中出現結晶現象而影響使用效果,選用相容性好的甘油進行濃度配方。按照試驗篩選得到助劑配方,加入不同含量的甘油,配制成不同的樣品,然后將樣品經過\\(0±2\\)℃貯存24h后,測定產品的懸浮率、析水率和分散性\\(表7\\)。測定結果表明,5.00%甘油的防凍效果好于3.00%和4.00%的甘油,且樣品中無析水現象。 2.6消泡劑的選擇 在懸浮劑砂磨過程中,會產生大量的泡沫,需要加入小量消泡劑。試驗結果表明,正辛醇添加到0.20%時,便有良好的消泡效果。 2.7懸浮劑的穩定性 將試驗結果得到的最佳配方:Y2菌粉5.00%,農乳342.50%,D-4252.00%,OP-101.50%,黃原膠0.15%,尿素0.15%,對羥基苯甲酸甲酯0.06%,甘油5.00%,正辛醇0.20%,水83.44%,采用濕磨法研磨4h后制得樣品后,測定懸浮劑的各項質量指標\\(表8\\)。 懸浮劑穩定性的測定結果表明:Y2懸浮劑的芽孢含量達50億/mL,懸浮率達92.00%以上,≤5μm的粒徑高于96%,pH值穩定在7.5~7.6,粘度610~620Pa·s;制劑的傾倒性好,熱貯和冷貯前后差異不大。 3、討論 紫外光對活體的殺傷作用是影響生防制劑在田間穩定性的重要因素,在生防制劑中加入一定量的紫外保護劑來保障生防活體在環境中的存活率是一種常用手段。本試驗結果表明,黃原膠和尿素在生物相容性良好的條件下對Y2芽孢表現出良好的防護作用。黃原膠防護效果與程立君等的研究結果一致。然而,在紫外保護劑篩選時,紫外燈照射時間存在較大差異,從照射30s到24h不等,其中以短時間照射為多。本試驗中以紫外燈照射5min后,全部Y2芽孢幾乎死亡。尿素對作物葉片損傷較小,適宜作葉片追肥。袁立海等的研究結果表明,尿素的葉面追肥量不超過5.00%時有良好增產效果且不會導致燒苗。本試驗添加0.15%尿素,具有芽孢紫外保護劑作用,同時還具有葉片追肥的功效,但增產效果有待進一步驗證。 懸浮劑實際上仍是水分散體系,其中添加的某些助劑是有機營養成分,在室溫下容易被外界雜菌所利用,導致制劑系統平衡的破壞。同時,生防活體微生物也有自身利用的條件。為了防止出現這些現象,農藥劑型中常加入山梨酸鉀、苯甲酸鈉和甲醛。本研究結果顯示,制劑中添加0.10%~0.30%的山梨酸鉀、苯甲酸鈉無防腐效果,其原因是該2種物質為酸性防腐劑,而解淀粉芽孢桿菌B9601-Y2懸浮劑是弱堿性制劑\\(pH7.6\\)。因此,將酸堿適應范圍大的對羥基苯甲酸甲酯作為Y2懸浮劑的防腐劑,能明顯抑制霉變和芽孢萌發,盡管其價格是苯甲酸鈉的10倍、山梨酸鉀的3倍,但添加量只需二者的1/10~1/5,制劑的成本相差無幾。 參考文獻：
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