細菌性果斑病\\(bacterial fruit blotch,BFB\\)是多種瓜類作物的重要病害,病害主要侵染源為種子帶菌。在中國,BFB是一種檢疫性病害,其病原菌為燕麥嗜酸菌西瓜亞種\\(Acidovorax avenae ssp.citrulli,Aac\\),屬革蘭氏陰性菌。

Aac可在植株的葉片、莖部和果實等部位引起病害,尤其以苗期及果實期危害最嚴重。苗期發病可導致整株幼苗死亡,而在果實上發病則造成減產,甚至絕收。該病害在高溫高濕的環境下發病十分迅速,迄今為止在世界范圍內還沒有完全免疫BFB的葫蘆科作物品種。BFB在中國新疆、內蒙古、海南、湖北、河南等許多地區均有發生,并給瓜類生產造成極大的經濟損失。

近幾年來,隨著育苗工廠集約化的迅速發展,西甜瓜嫁接苗技術已廣泛運用于大型的育苗工廠中。

該技術在防治西甜瓜枯萎病等多種土傳病害上具有很好的效果,但育苗工廠中育苗的密集性和適宜Aac存活與生長的高溫高濕環境,也為細菌性果斑病在嫁接育苗過程中的存活和大規模爆發提供了有利條件。目前,對工廠化育苗中細菌性果斑病苗期的侵染途徑研究較少。筆者分析了葫蘆砧木種子中不同Aac帶菌量與砧木苗期細菌性果斑病發生的關系,旨在明確細菌性果斑病通過種子帶菌引起苗期發病的侵染途徑,為嫁接苗工廠化育苗生產和有效防治細菌性果斑病提供理論依據。

1、材料與方法

1.1試驗材料

供試砧木葫蘆種子品種為京欣砧1號,由北京京研益農科技發展中心提供;燕麥嗜酸菌西瓜亞種\\(Aac\\)菌株Pslb96由中國農業科學院植物保護研究所趙廷昌研究員惠贈。試驗固體培養基為KBA培養基\\(蛋白胨20g、硫酸鎂1.5g、磷酸氫二鉀1.5g、甘油10g、蒸餾水1 000mL、瓊脂20g、pH 7.0~7.4\\),液體培養基為KB\\(無瓊脂KBA培養基\\)。育苗基質為有機營養土,由鎮江培蕾基質科技發展公司生產。

1.2 Aac菌液配制參考Dutta等的方法配制Aac不同濃度菌液。將Pslb96株劃線接種在KBA平板上,置于28℃培養箱內,培養2d后挑取單菌落,接種在KB培養液中,在30℃下搖培\\(250r/min\\)過夜。將菌液于6 000r/min離心5min。棄上清后,菌體用0.1×PBS緩沖液重新懸浮。用分光光度計測定菌懸液的吸光值\\(D600\\),并用PBS緩沖液將菌懸液的D600值調節至0.3\\(菌體濃度約為1×108cfu/mL。

最后用0.1 × PBS緩沖液將菌懸液的濃度分別調節至1×103、1×105、1×107cfu/mL。

1.3 Aac接種與病害調查參考王曉東的方法用不同濃度的菌懸液處理葫蘆砧木種子。 砧木種子用5% NaClO消 毒5min,隨后用無菌水中浸洗3次,并將其浸泡在各濃度Aac菌懸液中1h。以浸泡在無菌水中的種子作為對照,各處理48粒種子。最后將清洗后的種子在室溫 下晾干過夜,在30℃恒溫培養箱中催芽72h,將葫蘆砧木種子播種在穴盤內的基質中,每穴1粒種子。將穴盤置于日溫為28~32℃,夜溫為20~22℃的溫室中\\(無補光措施\\)進行育苗。分別在接種后4、6、8、10、12d逐株檢查幼苗發病情況,統計發病率與病情指數。病害等級分級標準參考金巖的方法并略加修改,即按照病斑面積占總子葉面積百分比進行分級:0級,不發病;1、2、3、4、5級,病斑面積分別為<5%、5% ~20%、20% ~40%、41%~60%、>60%。各處理重復3次。

1.4 Aac侵染觀察與病菌分離用濃度為1×107cfu/mL的Pslb96菌液浸泡葫蘆砧木種子1h,并將種子播種在穴盤中,在溫室播種后連續觀察幼苗的發病情況和發病部位,再分別在播種4、6、8、10d后取子葉下胚軸0~3cm和3~6cm處進行Aac的分離。將幼苗的不同部位在5%的NaClO溶液中表面消毒3min,用無菌水沖洗3次后,將病組織浸入無菌水中并搗碎,靜置20min使組織中病菌釋放入水中。然后將組織懸液進行梯度稀釋,涂布于含有氨芐青霉素\\(1mg/mL\\)和黃連素 \\(20mg/mL\\)的選擇性培養基上,28℃下培養48h。統計類似Aac菌落數量。為驗證分離的細菌是Aac,在平板上挑取疑似Aac單菌落5個,接種在含氨芐青霉素\\(1mg/mL\\)和黃連素\\(20mg/mL\\)的KB培養基中搖培過夜,菌液用Aac特異性引 物WFB1和WFB2進行PCR擴增以確定目標菌是否為Aac。

1.5 Aac在葫蘆幼苗中定殖的觀察。取下胚軸有明顯細菌性果斑病病癥的砧木幼苗,將其下胚軸發病部位剪下,并進行FAA固定,梯度乙醇脫水,石蠟滲透包埋、切片、去蠟、蕃紅固綠染色、二甲苯透明、香脂封固,最后制成石蠟切片。石蠟切片的操作參考方中達的方法。制成的石蠟切片在微分干涉顯微鏡下進行觀察,明確樣品中Aac在砧木下胚軸中的定殖部位。

2、結果與分析

2.1 Aac接種量對葫蘆苗期BFB發生的影響

試驗結果表明,在相同的高溫高濕育苗環境條件下,Aac菌株Pslb96不同接種量浸泡處理均可引起葫蘆幼苗發生BFB,且處理間發病率及病情指數均存在顯著差異。隨著浸種菌體濃度的增加,在播種后不同時間觀察葫蘆苗期發病率和病情指數均呈上升趨勢,4~8d時發病率和病情指數上升較快,8~12d時趨于緩慢 \\(圖1\\)。在播種后12d,當Pslb96浸種濃度為1×103cfu/mL時,葫蘆幼苗發病率達到55%,病情指數為37;當Pslb96浸種濃度為1×107cfu/mL時,葫蘆幼苗發病率可達到99%,病情指數為90。

2.2葫蘆苗期Aac的侵染過程

對葫蘆幼苗BFB癥狀出現的動態觀察結果表明,BFB在高溫高濕的育苗環境條件下發展迅速。病害發生初期子葉有輕微水漬狀病斑,隨著葫蘆砧木幼苗的生長,細菌性果斑病開始由發病子葉逐漸向葉基部進行擴展,并侵染幼苗下胚軸\\(圖2\\)。

Aac病原菌分離試驗結果表明,Pslb96浸種后,隨著葫蘆種子的萌發及幼苗的生長至4d時,子葉開始出現水漬狀病斑且可在葫蘆砧木幼苗子葉中分離到Aac,下胚軸健康且未分離到Aac\\(表1\\)。浸種后6d,子葉出現典型細菌性果斑病水漬狀病斑,下胚軸未表現癥狀,但可在下胚軸距子葉0~3cm處分離到Aac;浸種后8d,除子葉外,在下胚軸距子葉0~3cm部分出現水漬狀病斑并可也分離到Aac;浸種后10d,子葉、下胚軸距子葉0~3cm部分及下胚軸距子葉3~6cm部分均出現典型水漬狀病癥和黃褐色病斑并可分離到Aac。

2.3 Aac在葫蘆砧木苗期下胚軸的定殖

發病砧木幼苗下胚軸組織橫截面的石蠟切片染色觀察結果表明,Aac定殖于下胚軸維管束的木質部和韌皮部中,而下胚軸薄壁組織中未觀察到Aac的存在\\(圖3\\)。

3、討論

病原物能夠侵入成功的影響因素之一是接種體的數量。病原物需要有一定的數量才能引起侵染和發病。本研究結果表明,砧木用葫蘆幼苗期細菌性果斑病發生的嚴重程度與其種子含有Aac的帶菌量有密切關系。在相同的育苗環境中,種子內部Aac含量越多,葫蘆砧木幼苗的發病率和病情指數越高,所造成的危害越嚴重。而且,在較低的Aac帶菌量下\\(103cfu/mL\\),12d后細菌性果斑病發病率依然可達到50%以上,病情指數達到30以上。

此外,隨著時間的推移,砧木苗期的發病會愈發嚴重,甚至造成砧木的死亡。因此,對于細菌性果斑病發生嚴重的育苗工廠,砧木種子嚴格的消毒處理是非常有必要的,否則會對工廠化大規模育苗造成極大的經濟損失。到目前為止,關于西瓜細菌性果斑病侵 染方面 的研究 還不夠完善和深入。

Walcott等的研究表明西瓜細菌性果斑病可以在花期侵染花瓣而產生帶菌但無病癥的果實,且果實中的種子內可以檢測到Aac的存在。Lessl等證明Aac在適宜的環境條件下可以迅速定殖在西瓜雌花的柱頭上,并可通過輸導組織侵染子房。

Dutta等曾解剖被Aac感染的西瓜病果中的種子,發現Aac在種子的種皮、種殼和胚中均可定殖。但是,關于西瓜細菌性果斑病菌在葫蘆科作物苗期的侵染,特別是關于工廠化育苗中細菌性果斑病對砧木的侵染還鮮有報道。本試驗通過對Aac在病組織內定殖位點的觀察及對砧木幼苗不同部位Aac病原菌進行分離,發現Aac以種傳途徑作為初侵染來源時,病菌可隨著砧木苗期的發育進行侵染。研究結果表明,Aac侵染后首先在幼苗子葉表現癥狀,環境條件適宜時發病迅速,隨著幼苗的生長,病菌可沿子葉向下胚軸侵染,并使下胚軸發病。通過對下胚軸發病組織的切片觀察表明,Aac定殖于葫蘆砧木幼苗下胚軸維管束組織的木質部和韌皮部中造成系統性侵染。在育苗工廠高溫高濕的環境中,葫蘆作為嫁接砧木,如果忽視子葉上輕微的病斑,病害很容易擴展至下胚軸造成整株死亡,對育苗工廠造成極大的經濟損失。但是,砧木嫁接后是否能將病菌傳染給西瓜接穗,尚需進一步研究。