含酚廢水是水體重要污染物之一，其主要來源于焦化或以苯酚或酚醛為原料的化工生產過程。廢水中的酚類物質可直接抑制土壤及水體中生物的正常生長，嚴重破壞環境生態系統。在含酚廢水中，以苯酚毒性最大，通常含量也最高?，F已經證明低濃度苯酚能使蛋白變性，而高濃度苯酚則直接導致蛋白質沉淀，引起生物組織深部損傷、壞死乃至整體中毒。
正是由于苯酚具有的生物危害性，美國環保署\\(EPA\\)把苯酚列入水體 129 種優先污染物中的第 65 位，并且規定廢水中酚的濃度不得超過 1 mg/L；我國也把苯酚列入中國環境優先污染物黑名單之中，并且對含酚廢水的排放有嚴格的規定：一般條件下，規定飲用水的含揮發性酚的濃度為 0.001 mg/L，水源水體中含酚最高容許濃度為 0.002 mg/L。
世界各國普遍重視含酚廢水的處理，人們運用各種物理化學方法去除廢水中的苯酚，例如溶劑萃取法、吸附法、化學氧化法及焚燒法等。但這些方法都具有一定的缺陷，例如成本高，耗能，排放更毒的副產物及不能完全去除苯酚等。在過去的幾十年間，通過研究發現，許多微生物能以苯酚為唯一的碳源進行生長\\(表 1\\)。目前己基本了解微生物降解苯酚的生物學途徑主要有兩條：一條是好氧微生物利用苯酚羥化酶將苯酚氧化為鄰苯二酚、乙酰輔酶A、琥珀酸及丙酮酸等，然后這些物質進入三羧酸循環繼續被微生物利用；另一條則是通過厭氧微生物將苯酚羧化為 4-羥基苯甲酸，然后經過相關酶的作用，通過苯甲酸途徑，生成乙酰輔酶 A，最終轉化成乙酸，繼續被微生物利用。與物理化學法相比，微生物降解苯酚的成本較低，環境友好，操作簡單，但是高濃度的苯酚會抑制微生物的生長，從而影響苯酚的生物降解速率。因此篩選出能夠耐高濃度苯酚的微生物是實現苯酚生物降解的關鍵。
碟管式反滲透技術\\(DTRO\\)是一種新的水處理技術，通過碟管式的裝置實現反滲透以達到高效處理污水的效果。該技術運用反滲透原理，即在濃溶液一邊加上比自然滲透壓更高的壓力，扭轉自然滲透方向，把濃溶液中的溶劑\\(水\\)壓到半透膜另一邊的稀溶液中。目前該技術多應用于垃圾填埋場的滲透液處理和海水的淡化上，本實驗首次將這種技術用于含酚廢水的處理。單獨使用這種技術雖然能夠有效地降低廢水中苯酚的濃度，但在此過程中膜容易被苯酚腐蝕，從而導致膜使用壽命降低。
本實驗利用煤化工環境廢水及附近土樣微生物細菌群，通過在以苯酚為唯一的碳源培養基上進行篩選、馴化和分離得到高效苯酚降解菌，并將此菌種制備成相應的水處理劑與DTRO 技術結合形成一種新的生物強化 DTRO 技術，為創制降解苯酚工業菌劑及其在煤化工領域的用途提供相關基礎數據。
1 材料與方法

1.1 土壤浸漬液的準備

從云南開遠解化化工公司生產部污水處理系統底部取出污泥樣品，裝入已滅菌的自封袋中，帶回實驗室置于 4 °C 冰箱中保存備用。然后各稱取污泥 10 g，放入裝有 90 mL 無菌水的錐形瓶中，振蕩 4 h 后 2 000 r/min 低轉速離心，取上層液體備用。

1.2 培養基

1.2.1 無機鹽基礎培養基\\(g/L\\)：KH2PO41.0，K2HPO41.0，MgSO40.4，CaCl20.4，NaCl 0.2，\\(NH4\\)2SO40.1，FeSO4微量，瓊脂 20，用 NaOH 調整其 pH 8.0；1×105Pa 滅菌 20 min。
1.2.2 純培養斜面培養基：參照文獻[30]進行配制。
1.2.3 NA 培養基：參照文獻[31]進行配制。
1.2.4 液體種子培養基\\(g/L\\)：蛋白胨 1.0，酵母膏 0.5，NaCl 1.0，用 NaOH 調整 pH 為 7.5 7.8；1×105Pa 滅菌 30 min。
1.2.5 苯酚降解培養基：專用菌劑培養基\\(g/L\\) \\(酵母膏 0.2，蛋白胨 0.8，\\(NH4\\)2SO40.2，MgSO40.6。酵母膏和蛋白胨成分在 40 h 后添加。搖瓶實驗時還需補充 1.2.1 中其他無機成分，但在組合驗證時則無須補充\\)。1×105Pa 滅菌 30 min 后添加不同濃度苯酚溶液\\(苯酚濃度分別為 1000、1 500、2 000 mg/L\\)。

1.3 苯酚降解菌的富集培養

5 mL 的污泥浸漬液分別加入 100 mL 具有不同苯酚濃度的無機鹽培養基中\\(苯酚濃度分別為 500、1 000、1 500、2 000、2 500 mg/L\\)，于 28 °C、210 r/min 的搖床中培養 240 h。然后將各苯酚濃度富集培養液涂布于不同苯酚濃度無機鹽基礎培養基瓊脂平板上，在 28 °C 的恒溫箱中培養 48-96 h 后，將單菌落采用四分區劃線法接種在純化培養基的固體平板上。用保鮮膜封存好，置于 28 °C 的恒溫箱中培養。最后挑取單一菌落于純化斜面備用。

1.4 苯酚高效降解菌的分類鑒定

1.4.1 菌株 Phe-3 和 Phe-5 的生理和生物化學特征：參照文獻[32]的方法來進行。
1.4.2 菌株的電鏡顯微照片：由掃描電子顯微鏡拍攝\\(Quanta 200，FEI 公司，美國\\)。
1.4.3 16S rRNA 基因的擴增與測序：菌株 Phe-03 和 Phe-05 在 NA 平板培養基上 28 °C 培養 3 d，然后挑取適量的菌體于微量離心管中，基因組 DNA 的提取按照參考文獻[33]進行。
16S rRNA 基因的擴增與測序：16S rRNA 基因由兩個引物\\(27F：5′-AGA GTT TGA TCC TGGGCG CTC AG-3′；1541R：5′-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CAG-3′\\)來擴增。擴增體系含有 DNA 模板\\(大約 20 100 ng DNA\\) 1 μL；10×PCR 緩沖溶液\\(100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3；500 mmol/L KCl；15 mmol/L MgCl2\\) 5 μL，dNTPs 混合物\\(每個 dNTPs 濃度為 2.5 mmol/L，TaKaRa\\) 4 μL， 1.25 U Taq 酶\\(TaKaRa\\)， 兩個引物\\(終濃度為 0.4 μmol/L\\)各 1 μL，補足無菌去離子水 50 μL。PCR 擴增儀器為 GeneAmp PCR system \\(美國 PE 公司\\)，擴增程序為：95 °C4 min；94 °C 1 min，60 °C 1 min，72 °C 1 min，35 個循環；72 °C 10 min。PCR 產物用 1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，然后用手術刀切出 1 500 bp 大小的片段，用膠回收試劑盒\\(WATSON Gel Extraction Mini Kit\\)回收并純化目的片段。然后用 AB I PR ISM 377–96sequencer 直接測定序列， BigDye \\( Perkin2Elmer\\)作為終止劑，測序引物為 27F 和 1541R。
測序反應體系：純化后的擴增產物約 1 μL \\(約 30 ng\\)，BigDye 2.5 μL，引物 1 μL \\(約 3.2pmol/L\\)，用水補足 10 μL。擴增程序為：95 °C 1 min，56 °C 1 min，72 °C 1 min，35 個循環；72 °C，5 min；4 °C 保存。
1.4.4 系統發育樹的構建：測得的 DNA 序列經 NCBI \\(National Center for BiotechnologyInformation\\) BLAST 引擎搜索后獲取相關種屬的 16S rRNA 基因序列，用 ClustalX 1.8 軟件進行排列。系統發育分析時排除堿基缺失位點，用鄰接法\\(Neighbor-Joining analysis\\)構建系統發育樹。距離矩陣按照 Kimura’s 雙參數模型進行計算，Bootstrap 檢驗進行 1 000 次取樣。

1.5 苯酚分析方法

采用高效液相分析方法測定苯酚濃度。HPLC 分析柱規格：YMC HPLC 苯酚專用分析柱\\(Hydrosphere C18250 mm×4.6 mm，5 μm，Japan\\)；HPLC 分析系統為乙腈:水=80:20\\(體積比\\)等度；流速 1.0 mL/min；柱溫 37 °C；在此條件下苯酚的出峰時間為 10.75 min。在 0-1 000mg/L 范圍內，苯酚濃度與峰面積呈線性關系\\(R2=0.998 9\\)。苯酚濃度計算按回歸方程進行計算：苯酚濃度\\(mg/L\\)=\\(測定峰面積 24 055\\)/4 382.7。

1.6 菌株降解苯酚分析

1.6.1 分離菌株降解苯酚性能初篩：配制無機鹽培養基\\(每 250 mL 搖瓶中裝 82 mL 培養液\\)。待滅菌冷卻至適溫后向搖瓶中均加入 18 mL10 g/L 的苯酚濃溶液，使得發酵瓶中含量達到 1800 mg/L。然后在無菌條件下，用消毒過的吸管從種子瓶中分別吸取菌液 5 mL 轉接入搖瓶中\\(對照不進行接種\\)，于 28°C、210 r/min 培養 120 h。各取樣 1 mL 發酵液，12 000 r/min 離心 2 min 后，上清液進行高效液相色譜分析，每樣重復 3 次測定，取平均值進行分析。
1.6.2 性能良好菌株降解苯酚性能考察：配制無機鹽培養基\\(每 250 mL 搖瓶中裝 87 mL 培養液\\)。待滅菌冷卻至適溫后向搖瓶中均加入 13 mL 10 g/L 的苯酚濃溶液，使得發酵瓶中含量達到 1 300 mg/L。然后在無菌條件下，用滅菌過的吸管從種子瓶中分別吸取菌液 5 mL 轉接入搖瓶中\\(對照不進行接種\\)，于 28 °C、210 r/min 培養 120 h。每 12 h 各取樣 1 mL 發酵液，12 000 r/min 離心 2 min 后，上清液進行高效液相色譜分析，每樣重復 3 次測定，取平均值進行分析。菌體量的測定通過分光光度計\\(OD600\\)進行測量。

1.7 苯酚降解菌DTRO組合工藝

將篩選出來的苯酚降解菌在專用生物培養器內擴繁\\(已申請中國發明專利保護。申請號：201210078150\\)，添加專用營養劑\\(數據見 1.2.5\\)后制備成相應的水處理劑，然后與碟管式反滲透技術相結合用于對含苯酚廢水的處理，即在 DTRO 工藝基礎上，嫁接高效生物降解酚類物質的強化技術。觀察反滲透膜的反應，并與單純使用 DTRO 技術的結果進行對比。圖 1是含酚廢水 DTRO 生物強化技術處理的工藝流程圖。2 結果與分析

2.1 苯酚降解菌的獲得

通過平板分離，我們觀察到在 500-2 500 mg/L 苯酚濃度下，隨著苯酚濃度的不斷提高，平板上可培養微生物的種類越單一。通過觀察，我們最終選擇分離純化在 1 000-2 000 mg/L苯酚濃度下生長呈優勢的菌株\\(表 2\\)
2.2 分離菌株實際降解苯酚的效果測定

2.2.1 分離菌株苯酚降解性能初篩：從分離獲得菌株 120 h 降解苯酚情況看，所有菌株均具備一定的降解苯酚能力\\(表 3\\)。其中，Phe-03 及 Phe-05 菌株降解能力較強。另外，考慮到本研究今后涉及的煤化工含酚污水中苯酚的濃度一般在 800-1 000 mg/L，且 1 800 mg/L 濃度的苯酚可能極大影響菌株的生長，影響苯酚的降解效率，故選擇 Phe-03 及 Phe-05 菌株進行后續驗證實驗，并進一步將苯酚的起始濃度降低為 1 300 mg/L。
2.2.2 Phe-03 及 Phe-05 菌株苯酚降解性能比較：通過測定 Phe-03 及 Phe-05 在不同時段下的苯酚降解量情況\\(圖 2\\)；可以看出在培養 76 h 后，菌株 Phe-05 及 Phe-03 苯酚降解率均達到了 90%以上。但 Phe-05 菌株更適應培養環境，從圖 2 中可以明顯發現 Phe-05 菌株在經過12 h 的延遲生長后，OD600值呈快速增長趨勢，表明在 12–44 h 期間菌株生長活力旺盛；與此同時，與 OD600生長曲線對應的苯酚降解曲線也逐級走高。這些現象表明：伴隨著 Phe-05菌株的快速生長，苯酚作為唯一碳源物質也正在被快速消耗。44 h 以后，Phe-05 菌株的生長接近對數生長末期，也隨著培養系統內苯酚殘存濃度的降低，苯酚的降解率趨于穩定，苯酚降解曲線也趨于平緩。Phe-03 菌株的在 44 h 前的生長情況明顯要比 Phe-05 菌株要遜色。
特別的是該菌株在 24–32 h 期間有一個明顯的生長平臺期，而且苯酚的降解在該階段也有趨緩態勢。我們初步判斷可能與菌株培養系統內\\(NH4\\)2SO4濃度過低\\(與 Phe-05 菌株相比，Phe-03 培養系統內\\(NH4\\)2SO4濃度減少了 60%\\)有關。作為一種無機速效氮源，\\(NH4\\)2SO4的快速消耗必定會嚴重影響菌株一些重要生理物質比如與苯酚降解酶的生物合成，從而進一步影響了菌株的生長狀況；而在 32 h 后 Phe-03 菌株生長又突破了前期平臺繼續呈增長趨勢，針對該現象，我們認為可能是在此階段添加在培養系統中的有機氮源物質發揮了作用，從而繼續推動菌株發揮其生理功能。而未加菌的苯酚同步陰性對照在整個反應過程中濃度變化有一定起伏，但變化不大。說明僅僅依靠苯酚的自身揮發不能有效降低苯酚在水中的濃度。該結果也從一個方面證實微生物對苯酚降解的推動作用。

2.3 苯酚高效降解菌株 Phe-03 與 Phe-05 的分子生物學鑒定

從平板培養上看 Phe-03 菌落質地柔軟，帶有白色微黃的顏色，而 Phe-05 菌落成片，質地柔軟，呈白色。Phe-03 菌株呈短桿狀[\\(0.1–0.2\\) μm×0.5 μm。見圖 3]；革蘭氏染色呈陽性；檢測生長溫度 20–38 °C \\(適宜生長溫度為 28–32 °C\\)；檢測生長 pH 4.5–9.0 \\(適宜 pH 6.0–8.0\\)；纖維素、淀粉、酪蛋白水解陰性；可利用葡萄糖、蔗糖，不產 H2S；甲基紅實驗陽性；吲哚實驗陰性；VP 實驗陰性；檸檬酸鹽利用陰性。Phe-05 菌株呈短球桿狀[\\(0.2–0.3\\) μm×0.5 μm。見圖 3]；革蘭氏染色呈陽性；檢測生長溫度 20–38°C \\(適宜生長溫度為 28 °C\\)；檢測生長 pH4.5–9.0 \\(適宜 pH 6–8\\)；纖維素、淀粉、酪蛋白水解陰性；可利用葡萄糖、蔗糖。H2S 實驗弱陽性；甲基紅實驗陰性；吲哚實驗陰性；VP 實驗陰性；檸檬酸鹽利用陰性。2 株菌均可以苯酚為唯一碳源生長。
根據 16S rRNA 基因有效序列分析構建的系統進化樹。所有分支均采用最小二乘法\\(Least-squares\\)和極大似然\\(Maximum-likelihood\\)構樹算法進行過計算和驗證。分支節點上的數字表示經過 1 000 次自舉\\(Bootstrap\\)分析所支持的結果。該結果表明所有菌株在進化樹上的位置可靠\\(Bootstrap 值>70\\)。線段標尺\\(0.005\\)表示 0.5%序列差異的分支長度。由系統進化樹可
以得知 Phe-03 與 Agromyces soli \\(GQ241325\\)的序列最大相似性達到 100%，故可推斷 Phe-03 屬于壤霉菌屬\\(Agromyces\\)屬的菌株；Phe-05 與最接近菌株 Corynebacterium lubricantis \\(FM173119\\)序列最大相似性小于 98%，推斷 Phe-05 為棒桿菌屬\\(Corynebacterium\\)的菌株。

2.4 苯酚降解菌-DTRO 工藝集成試驗

實驗結果表明\\(表 4\\)：與單純使用 DTRO 技術相比，這種生物強化 DTRO 集成技術對含酚廢水的處理效果更好，可有效控制含酚廢水中酚類物質的濃度，減少膜污染，增大通透性，延長膜壽命。新工藝對高濃度含酚廢水進行深度處理，處理效果好，出水水質達到《污水綜合排放標準》GB8978-1996 一級標準，可用于含酚廢水處理。
3 討論

從煤化工污水處理系統污泥樣中分離純化了 2 株高效降解苯酚的菌株\\(分別編號為Phe-03 和 Phe-05\\)。它們均可以苯酚為唯一碳源生長。根據 16S rRNA 基因序列分析，初步判定 Phe-03 為壤霉菌屬\\(Agromyces\\)的菌株；而 Phe-05 為棒狀桿菌屬\\(Corynebacterium\\)的菌株。到目前為止，壤霉菌屬\\(Agromyces\\)微生物降解苯酚尚未見報道，因此 Phe-03 是苯酚降解菌的新成員。這為今后研究微生物降解苯酚提供了更多的選擇，目前該兩株菌已經申請了中國發明專利保護\\(Phe-05 菌株保藏編號為 CCTCC No：M2012031。專利申請號：
201310285990；Phe-03 菌株保藏編號為 CCTCC No：M2012030。專利申請號：201210057537\\)。根據相關文獻可知棒狀桿菌屬\\(Corynebacterium\\)中的一些微生物可以利用苯酚作為唯一的碳源和能源，本研究也證實了這一點。在這其中最典型的例子就是谷氨酸棒狀桿菌。許多文獻揭示了谷氨酸棒狀桿菌可以利用包括苯酚在內的各種芳香族化合物；目前對棒狀桿菌屬\\(Corynebacterium\\)微生物代謝苯酚的機制及其對苯酚污染環境修復研究已經有一系列深入報道?？傊?，該屬微生物菌株在環境修復領域可發揮重要作用。
另外，DTRO 作為一種新型的水處理技術，目前多應用在垃圾填埋場的滲透液處理和海水淡化上。但是由于其反滲透膜成本高，投資大，易受污染，常需清理，日處理量小等缺陷致使該技術推廣難度很大。因此 DTRO 技術目前還沒有運用到對含酚廢水的處理上。本研究首次將反滲透技術用于對含酚廢水的處理，并且結合由苯酚高效降解菌 Phe-03 與 Phe-05制備成的相應的水處理劑，形成生物強化 DTRO 技術。這種技術不僅可以有效的除去廢水中的苯酚含量，使得出水中未檢測到苯酚，而且對污水中 CODcr、NH3-N 和油類等常規性指標去除率也都達到了較為理想狀態。更重要的一點是這種技術的運用可以減少反滲透膜的污染，增加膜通透性提高了工業廢水的處理水平，在一定程度上解決了將 DTRO 技術運用到含酚廢水處理上的可能性。但要真正實現微生物技術與 DTRO 的有效對接還必須解決以下問題：\\(1\\) 微生物菌株在系統中的有效定植；\\(2\\) 微生物菌株在水處理系統溫度變化情況下苯酚降解效率的穩定性；\\(3\\) 外加有機氮源是否造成二次污染；\\(4\\) 菌株的生物安全性評價。通過本研究工作，表明微生物技術可與 DTRO 技術聯用，構建含酚廢水生物強化處理工藝；本工作可為含酚廢水處理研究提供一種選擇思路。

參 考 文 獻
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