1993 年 O'Down 等[1]首次發現 7 次 α 螺旋的跨膜區段組成的 G 蛋白偶聯受體 APJ（ apelin-angioten-sin receptor-like,APJ） .1998 年，Tatemoto 等[2]從牛的胃蛋白提取并純化 APJ 的內源性配體 apelin.Apelin / APJ 系統組織分布廣泛，生物學功能多樣。
研究發現，Apelin 具有舒張血管、降低血壓、增強心肌收縮力、調節下丘腦-垂體激素釋放、抑制抗利尿激素的釋放、調節攝食攝水以及抵抗艾滋病毒侵入細胞等多種生物學效應。Apelin/APJ 系統還參與糖尿病腎病、大血管并發癥、視網膜新生血管的發展，是一種重要的生理調節肽。Apelin / APJ 系統具有促進細胞增殖的作用。
Apelin 在人的成骨細胞大量表達，可刺激成骨細胞的增殖。在鼠的胃上皮細胞含有大量 Apelin,并證明在體外 Apelin 刺激胃上皮細胞的增殖。Apelin 具有血管生成因子的作用，研究發現在視網膜血管內皮細胞中，Apelin-13 和 Apelin-36 呈濃度依賴性促進細胞遷移、增殖和毛細血管形成。骨髓間充質干細胞（ bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）主要來源于骨髓組織，具有多向分化潛能，增殖迅速、可塑性、可移植性及自我更新能力強。在體外可被誘導分化為成骨細胞、脂肪細胞、血管內皮細胞、神經元樣細胞等，這正是其多向分化潛能特點的體現。文獻[3]報道 apelin 能夠參與多種細胞增殖的過程，但 apelin 是否能影響骨髓間充質干細胞的增殖尚不清楚，也未見相關報道。本文旨在探究 ape-lin 是否促進骨髓間充質干細胞的增殖。
1 材料與方法
1. 1 試劑與材料 Sprague-Dawley （ SD） 大鼠購自湖南農業大學動物部； Apelin-13 多肽（ 057-19） 購自美國 Phoenix Biotech 公司； 培養基、血清、胰酶等均購自美國 Gibco 公司； MTT 購自美國 Sigma 公司；GNP-9080 隔水式恒溫培養箱（ 上海精宏實驗設備有限公司） ; 流式細胞儀（ 美國 Becton Dickinson 公司） ; 酶標儀（ 美國 Labsystem Dragon 公司） .
1. 2 大鼠骨髓間充質干細胞的分離與培養 將SD 大鼠浸泡于 75% 醫用酒精中 15 min,在無菌條件下切開大鼠組織，取股骨，去除表面軟組織，沖出骨髓，接種于培養瓶。用含 10%FBS 的 DMEM 高糖培養基，37 ℃ 5% CO2培育箱中孵育培養。當培養的原代細胞生長密度達到70% ~ 80%以上后，棄去原培養液，用 PBS 洗 2 次，加入 0. 05% 胰蛋白酶消化液，放置于 CO2培養箱中孵育 5 min; 用巴式吸管吸取培養基反復吹打培養瓶壁，當貼壁的細胞懸浮后，取懸浮液 800 r/min 離心 8 min; 棄去上清液，加入培養基，繼續培養至細胞重新懸浮時，分瓶進行傳代培養。倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態。
1. 3 流式細胞術檢測細胞周期 將細胞以 1 ×106cells / L 接種于六孔板，直到細胞生長至 70% ~80%狀態時，用含有0.1%胎牛血清胞培養24 h（ 細胞同步化） ,然后分別加入不同濃度 apelin-13 繼續孵育 24 h后用胰酶消化并收集細胞，PBS 洗兩遍，棄上清，加入1 mL 70% 預冷乙醇中，吹打均勻，4℃ 固定 12 h.PBS洗滌去乙醇，1 000 r/min,5 min,洗兩遍。0. 5 mL PBS重懸細胞，加入PI 和 RNaseA 至終濃度50 μg/mL,37℃溫浴30 min,上流式細胞儀測定細胞周期。
1. 2. 3 MTT 比色法測定細胞增殖 將細胞以 1 ×106cells / L 的濃度接種在 96 孔板中，直到細胞生長至 70% ~80%狀態時，再用含有 0. 1% 胎牛血清胞培養 24 h（ 細胞同步化） ,然后分別加入不同濃度apelin-13 繼續孵育 24 h,每孔加入濃度為 5 g / L 的MTT 20 μL,繼續培養 3 h,然后吸出孔內培養液后，加入 DMSO 在 37℃中孵育 15 min 以后將其震蕩混勻，再經酶聯免疫檢測儀測定 OD 值（ 570 nm 處的檢測波長） .
1. 2. 4 統計學分析 使用 SPSS 13. 0 軟件進行統計與分析，數據以 x ± s 表示。組間比較采用單因素方差分析，當 P <0. 05 即具有統計學意義。
2 結 果
2. 1 倒置顯微鏡觀察 apelin-13 對骨髓間充質干細胞增殖的影響 分別采用不同濃度 apelin-13（ 0. 1 μmol/L、1. 0 μmol/L 和 10. 0 μmol/L） 處理大鼠骨髓間充質干細胞 24 h 后，倒置顯微鏡下觀察細胞增殖，結果提示： apelin-13 顯著促大鼠骨髓間充質干細胞的增殖（ 見圖 1） .
2. 1 流式細胞術檢測 apelin-13 對骨髓間充質干細胞增殖的影響 表 1 表明，與對照組相比較，ape-lin-13 刺激后處于 S 期和 G2-M 期的細胞數目顯著增加，G0-G1 期的細胞數目顯著減少。apelin-13 刺激后增殖指數（ PI） 顯著增加。提示： apelin-13 顯著促進大鼠骨髓間充質干細胞的增殖。
2. 2 MTT 法觀察 apelin-13 對大鼠骨髓間基質干細胞增殖的影響 圖 2 表明 apelin-13（ 0. 1 μmol/L、1. 0 μmol / L和 10. 0 μmol / L） 處理大鼠骨髓間充質干細胞后，呈濃度依賴性促進細胞的增殖，且在 apelin-13 濃度為1 μmol/L 時，與對照組比較差異有顯著性，在apelin-13 濃度為 10 μmol / L 時促增殖作用最顯著。
3 討 論
血管緊張素受體樣受體 APJ 是一種孤兒 G 蛋白偶聯受體[1].Apelin 是 APJ 受體目前已知的唯一內源性配體[2].大量實驗表明，apelin 促進血管平滑肌細胞、視網膜血管內皮細胞、胃腺上皮細胞、脂肪細胞、成骨細胞等增殖過程。這些線索提示 ape-lin 可能參與骨髓間充質干細胞的增殖。
骨髓間充質干細胞具有多向分化潛能，具有快速增殖的能力，可以在體外可被誘導分化為成骨細胞、脂肪細胞、血管內皮細胞、神經細胞等。骨髓間充質干細胞已在退行性及缺損性疾病、心血管疾病、肝移植、肺纖維化等疾病治療方面取得良好效果。
骨髓間充質干細胞的植入物具有修復動物骨缺損的能力。將人骨髓間充質干細胞在體外培養，并貼附于生物材料上修復大鼠股骨干骨缺損也取得了好的效果。骨髓間充質干細胞在心梗后既能促進新血管的形成又有分化為心肌細胞的能力。
Apelin 促進細胞增殖[4-5],但 apelin 與骨髓間充質干細胞關系尚不清楚，本實驗采用不同方法初步證明apelin-13 促進骨髓間充質干細胞增殖。分別給予 ape-lin-13（ 0. 1 μmol / L、1 μmol / L、10 μmol / L） 處理細胞 24h 后，用流式細胞術和 MTT 比色法檢測到 apelin-13 顯著促進大鼠骨髓間充質干細胞的增殖，且在 apelin-13濃度為 1 μmol/L 時，與對照組比較有顯著性差異，10 μmol / L時增殖最顯著。以上結果表明 apelin-13 呈濃度依賴性促骨髓間充質干細胞的增殖。
骨髓間充質干細胞具有易獲得、易培養、低免疫原性、易于外源基因的轉入和表達等特性，且具有自我更新能力，并能迅速增殖，在組織器官移植中具有重要的應用價值[6].Apelin 能促進骨髓間充質干細胞的增殖，因此，高表達 apelin 的骨髓間充質干細胞或許能作為理想的種子細胞被廣泛應用于組織工程、細胞移植、基因治療及器官移植等領域。但 ape-lin 是如何影響骨髓間充質干細胞增殖，其分子機制還有待將來的進一步探討。
參考文獻：
[1] O'Dowd BF,Heiber M,Chan A,et al. A human gene thatshows identity with the gene encoding the angiotensin re-ceptor is located on chromosome 11[J]. Gene,1993,136（ 1-2） :355-360.
[2] Tatemoto K,Hosoya M,Habata Y,et al. Isolation andcharacterization of a novel endogenous peptide ligand forthe human APJ receptor[J]. Biochem Biophy Res Comm,1998,251（ 2） : 471-476.
[3] Li F,Li L,Qin X,et al. Apelin-induced vascular smoothmuscle cell proliferation: the regulation of cyclin D1[J].Front Biosc,2008,13（ 5） : 3786-3792.
[4] Li L,Xie F. Jagged-1/Notch3 signaling transduction path-way is involved in apelin-13-induced vascular smoothmuscle cells proliferation[J]. Acta Bio Biophy Sin,2013,45（ 10） : 875-881.
[5] Yang L,Su T,Lv D,et al. ERK1/2 mediates lung adeno-carcinoma cell proliferation and autophagy induced byapelin-13 [J]. Acta Bio Biophy Sin,2014,46 （ 2 ） :100-111.
[6] Wislet-Gendebien S,Hans G,Leprince P,et al. Plasticityof cultured mesenchymal stem cells: switch from nestin-positive to excitable neuron-like phenotype [J]. StemCells,2005,23（ 3） : 392-402.
