廣西巴馬縣是長壽之鄉，本課題組之前曾探討過 DNA 甲基化水平與巴馬長壽的相關性，發現巴馬人群和對照組的總體甲基化水平都呈增齡性下降，年齡與甲基化比值呈負相關，巴馬縣人群的 DNA 總體甲基化水平比對照組人群高，提示巴馬長壽現象可能與該地區人群較高的 DNA 總體甲基化水平有關.本文在前期研究的基礎上，借鑒 DNA 混合池研究基因甲基化的方法,尋找與廣西巴馬長壽相關的超甲基化位點和基因，進一步探討 DNA 甲基化與巴馬長壽的關系。
1 材料與方法
1. 1 研究對象 在廣西巴馬縣長壽家族中選取 60 例 90 ~ 110歲老人組成長壽組，在非長壽家族中選取 48 ~ 85 歲的健康者60 例組成對照組。
1. 2 主要儀器 紫外分光光度計（Eppendorf Biophotom） ,Hy-bridization system12 雜交儀（Roche-NimbleGen） ,MS200 掃描儀（Roche-NimbleGen） .
1. 3 方法
1. 3. 1 基因組 DNA 制備及混合池的構建 根據“知情同意”的原則抽取研究對象外周靜脈血 2 ml,提取基因組 DNA.參考Barcellos 等〔3〕的方法，構建四個 DNA 混合池： ①30 例有長壽家族史的 100 ~110 歲老人，男 5 例，女 25 例； ②30 例有長壽家族史的 90 ~99 歲老人，男 4 例，女 26 例； ③30 例無長壽家族史的48 ~ 75 歲健康對照者，男 5 例，女 25 例； ④30 例無長壽家族史的76 ~85 歲健康對照者，男6 例，女24 例。用紫外分光光度計測量每個 DNA 樣品濃度各 3 次，取平均值，再將樣品稀釋到終濃度為 100 ng/μl,從同一組的 30 個 DNA 樣品中各取 5 μl 混合，分別構建 4 個 DNA 混合池。前兩個混合池為長壽組，后兩個混合池為對照組，長壽組與對照組性別分布無顯著差異。
1. 3. 2 Roche-NimbleGen MeDIP.
1. 3. 2. 1 基因組 DNA 片段化 用 MseI（NEB,R0525S） 將基因組 DNA 消化過夜，然后用 QIAquick PCR Purification Kit （Qia-gen,28104） 純化片段化的 DNA,最后用分光光度計定量，并結合瓊脂糖凝膠電泳質檢。
1. 3. 2. 2 免疫沉淀甲基化的 DNA 將能與甲基化的 DNA 片段發生特異性反應的 momoclonal mouse anti-5-methylcytidine 抗體（Abcam,Ab10805） 與消化后的 DNA 孵育過夜。利用羊抗鼠IgG（Dynal,112-01D） 將 DNA-抗體復合物沉淀，清洗回收后用蛋白酶 K（NEB,P8102） 消化過夜，采用酚抽提、乙醇沉淀法回收 DNA.
1. 3. 2. 3 DNA 擴增標記 （1） 取上述免疫沉淀后的 DNA Me-DIP,采用 WGA2 Kit （Sigma,WGA2-50RXN） 擴增，利用 QIA-quick PCR Purification Kit 純化擴增后的產物，并對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳及定量。（2） 取上述擴增產物，利用熒光標記的隨機引物進行 klenow 酶（NimbleGen Dual-Color DNA Labe-ling Kit,05223547001） 反應標記，標記產物用異丙醇沉淀濃縮并定量。
1. 3. 2. 4 雜交與清洗、芯片掃描 將標記好的樣品 MeDIP 與Roche-NimbleGen 提供的雜交液配成合適體積，然后與芯片雜交，采 用 Roche-NimbleGen 的 Hybridization system12 雜 交 儀42℃ 雜交過夜。最后分別用洗液Ⅰ、洗液Ⅱ、洗液Ⅲ清洗芯片，甩干后在 Roche-NimbleGen MS200 掃描儀行掃描分析。
1. 3. 2. 5 芯片圖像的采集與數據分析 通過 5-甲基胞嘧啶抗體進行免疫沉淀、捕獲富集甲基化的 DNA 片段。采用 Nim-bleScan 進行圖像分析，將圖像信號轉化為數字信號，根據實驗樣品（IP） 和對照樣品（input） 之間的探針信號比值，用 Kolmog-orov-Smirnov 檢驗計算 P 值，P < 0. 01 視為甲基化程度較高的序列。
1. 4 差異甲基化基因的功能注釋 在分子注釋系統（MAS,ht-tp: / / bioinfo. cap-Italbio. com / mas） 上對差異甲基化基因的功能進行注釋。
2 結 果
2. 1 差異甲基化的篩選 利用芯片技術、根據 P<0. 01 的判斷標準，共篩查出 6 441 個超甲基化位點，甲基化值 0. 6 ~1. 0,其中長壽組 392 個，發生在甲基化島的位點有 189 個； 對照組6 049個，發生在甲基化島的位點有 2 407 個，長壽組和對照組發生在甲基化島的超甲基化位點數比例分別占各組位點總數的 48. 2% （189/392） 和 39. 8% （2 407/6 049） .超甲基化位點共涉及 1 618 個基因，長壽組比對照組甲基化程度高的基因有133 個，存在 CpG 島的基因有 75 個，占 56. 3% （75 /133） ,共形成 160 個 CpG 島； 而對照組比長壽組甲基化程度高的基因有1 485個，存在 CpG 島的基因有 640 個，占 43. 1% （640 /1485） ,共形成 1 268 個 CpG 島。
2. 2 長壽組超甲基化基因分析
2. 2. 1 長壽組超甲基化基因的功能注釋 將 133 個超甲基化基因數據輸入在線芯片 MAS 進行 GO（gene ontology） 分析，發現該組133 個超甲基化基因主要涉及24 種生物學功能，見表1.
2. 2. 2 長壽組超甲基化基因涉及的通路 將 133 個超甲基化基因輸入 MAS 在線分析軟件，利用其中的 KEGG 數據庫進行分析，結果表明，該 133 個超甲基化基因共涉及 42 個通路。q值越小，數據的可信度越高。表 2 中列舉了排位前 20 位的通路、涉及的基因數目及名稱。
2. 3 對照組超甲基化基因分析
2. 3. 1 對照組超甲基化基因的功能注釋 將 1 485 個超甲基化基因數據輸入芯片 MAS,發現該組1 485個超甲基化基因主要涉及 24 種生物學功能，見表 3.
2. 3. 2 對照組超甲基化基因涉及的通路 將 1 485 個超甲基化基因輸入 MAS 在線分析軟件，利用其中的 KEGG 數據庫進行分析，結果表明，該 1 485 個超甲基化基因共涉及 156 個通路。表 4 中列舉了排位前 30 位的通路及其涉及的基因數目。
2. 4 超甲基化基因與疾病的關系 超甲基化基因涉及的疾病眾多，見表 5.同時，單個基因也可能與多種疾病有關聯。
2. 5 超甲基化基因與其編碼的 miRNA 長壽組中有 113 個超甲基化基因編碼了 476 個 miRNA; 對照組中有 1 073 個超甲基化基因編碼了 478 個 miRNA,兩組超甲基化基因共同編碼的miRNA 有 476 個，包括 miR-103、miR-107、miR-130a、miR-155、miR-24、miR-221、miR-496 等。對照組超甲基化基因比長壽組多編碼的兩個 miRNA 是 miRNA-487a 和 miRNA-587.
3 討 論
3. 1 DNA 甲基化與衰老的關系 DNA 甲基化是指在甲基轉移酶的催化下，CG 兩個核苷酸中的胞嘧啶第 5 位碳原子被加上一個甲基基團、形成 5-甲基胞嘧的過程。甲基化模式很不穩定，受衰老、疾病、理化等因素的影響而發生改變。某些基因的異常甲基化與衰老有密切的關系。已有研究表明早衰癥與 LM-NA、WRN 基因突變有關，當基因突變同時伴有異常 DNA 甲基化時，將能增強發生該病的可能性，即基因突變與 DNA 甲基化在該病的發生過程中起到協同的作用〔4〕.
在 Davide 等〔5〕的研究中發現，與非長壽家族后代比較，長壽老人的后代發生增齡性總體甲基化水平下降并不明顯，其下降速度較前者慢，且總體甲基化程度較前者高。年齡相仿的兩個后代組人群間比較，有長壽家族史的后代在屢患慢性疾患、接受藥物治療、處方藥使用頻率等方面較沒有長壽家族史的后代少，表明該群體整體健康狀況更好。在兩群體間還篩選獲得有統計學差異的超甲基化位點，發現這些位點所在的基因涉及DNA 或 RNA 合成、代謝、細胞信號通路等生物學過程。以上發現提示，長壽家族的后代可能保留了更好的甲基化模式，能增強基因組和轉錄系統的穩定性，因此能推遲或延緩后代人群某些年齡相關慢性疾病的發生，達到延長壽限的目的。
DNA 甲基化與年齡有關，甲基化島會發生增齡性甲基化水平升高，而非甲基化島的情況卻恰恰相反，即存在增齡性甲基化水平降低的趨勢。位于啟動子區的 CpG 島發生甲基化時，往往會導致該基因表達下調，DNA 甲基化程度越高，基因轉錄活性越低，反之，甲基化越低，基因表達越高〔6〕.本研究發現巴馬長壽現象與 DNA 甲基化關系密切，并發現與長壽呈正相關和負相關的超甲基化位點和基因。巴馬地區人群的長壽現象是否歸因于系列疾病相關基因 CpG 島發生了超甲基化，導致基因表達受抑制，從而使人群免受疾病而延長了壽限？ 這還需要以具體的疾病相關基因進行深入的驗證。
3. 2 生物學功能與衰老的關系 兩組人群的超甲基化基因均涉及 24 個生物學功能，且均以細胞過程、生理過程、生物調控為主，提示兩組人群的衰老生物學基礎是相同的。有研究表明，衰老與炎癥反應有關聯，在隨訪 9 年的健康人群中發現，隨著年齡的增長，20% 以上的個體體內的炎癥物質 C-反應蛋白（CRP） 和白細胞介素（IL） -6 濃度雙倍增長，令人群屢患年齡相關的心血管疾病的危險度和發生死亡結局的風險增加〔7〕.年齡相關的神經元退行性病變與 RNA 氧化損傷有關，在只出現了輕度認知損傷階段、還沒達到阿爾茨海默?。ˋD） 臨床前期時，在神經元中已能檢測到 RNA 的氧化產物 8-羥基鳥苷。與年齡匹配的對照人群比較，最終會發展為 AD 的病例中能檢測到更高水平的 8-羥基鳥苷〔8〕.端粒是染色體終端結構，對染色體末端起著保護作用。端粒的長度隨著細胞的不斷分裂而縮短，其 DNA 丟失到一定程度時，細胞隨之發生衰老和死亡。本課題組之前的研究也表明，巴馬長壽與端粒的長度有關〔9〕.
3. 3 信號傳導通路與衰老、長壽相關性 生物性衰老過程會同時伴隨著單細胞水平自然殺傷細胞的細胞毒活性下降，但在健康老人及百歲老人中，細胞毒活性卻得到很好的保存，并可持續其一生，這可能是有助其達到高齡及百歲的原因〔10〕.本研究發現，在長壽組中有 4 個高甲基化基因 NFATC1、RAET1G、SHC2、ULBP1 落在自然殺傷細胞介導的細胞毒性信號通路上，而對照組則有 BID、ITGB2、NFATC1 等 11 個高甲基化基因落在此通路，說明自然殺傷細胞介導細胞毒性機制能影響巴馬長壽現象，推測是由于相關基因發生超甲基化后，導致其轉錄活性降低，從而其相關基因表達下調，抑制自然殺傷細胞的活性，進而影響機體的免疫能力。長壽組人群只有較少相關基因發生甲基化，故保存有較強的免疫功能，從而壽命得以延長。
同樣，絲裂原活化蛋白激酶信號通路也參與衰老調控。在動物實驗中發現 C-美麗線蟲的免疫衰老現象與絲裂原活化蛋白激酶信號通路 PMK-1 p38 活性下降有關〔11〕.分析對照組人群壽限較長壽組短的原因，可能與通路上較多相關基因發生甲基化、導致基因表達活性進一步下降有關。
在線蟲、果蠅和小鼠的研究中發現減少胰島素樣多肽可以延緩生物的衰老從而使其增加壽命〔12〕.在哺乳動物的研究中也發現胰島素和胰島素生長因子可以影響生物的衰老過程〔13〕.本次研究亦發現了長壽與胰島素轉導通路有關。推測對照組的多個胰島素信號通路相關基因甲基化后，降低了基因轉錄活性，進一步地加速組織衰老，而長壽組僅有 2 個基因出現高甲基化狀態，故可延緩衰老、增加壽命。
3. 4 差異超甲基化基因與疾病的關聯 在本次研究中，不管是長壽組還是對照組均存在與年齡相關疾病有關聯的差異超甲基化基因。有意思的是，在長壽組中與長壽有關的基因無一發生甲基化，對照組中卻有 ACSL1、C4A、CBS、CNN1、ETFA、HS-PA1L、SERPINE1 等基因處于超甲基化狀態，以上基因與脂質代謝、補體系統功能、免疫功能、皮膚膠原合成有關〔14 ~16〕.一個基因可與多種疾病有關聯，長壽組中 CCKBR、COL18A1、EGR3、H19、IL11、TIMP-1、S100A1 等超甲基化基因涉及幾十種疾病，以腫瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病為主，有些基因與疾病的關系已在人群研究中得到驗證，如 TIMP1 基因與人類皮膚衰老、S100A1 基因與腎臟腫瘤的關系.疾病相關基因發生甲基化后，其轉錄活性下降，使人群不易屢患相應疾病。對照組中也存在與數十種疾病相關的基因 ACSL1、ATP5I GCK、AD-CY8 等，以自身免疫性疾病、結締組織病、代謝紊亂性疾病多見。GCK 基因的失活與糖尿病的關系已得到證實，甲基化的ADCY8 基因是診斷早期胃癌的生物標志物，且此成果已取得了專利。由此可知，對照組人群中的特異性基因發生超甲基化失活后更容易出現相應的疾病，致使該人群的健康水平下降，不易維持健康狀態或達到長壽。
3. 5 超甲基化基因編碼的 miRNA 與衰老的關系 miRNA 的表達水平與衰老的關系已得到不少實驗研究的驗證，并發現了許多衰老相關的 miRNA,如 miR-103、miR-107、miR-130a、miR-155、miR-24、miR-221、miR-496 等，其表達水平會隨著年齡的增長而下降。此外，受 miRNA 調控的靶基因有 PI3K、c-Kit、H2AX 等，靶基因的表達水平卻會隨著年齡的增長而升高.
據文獻報道，PDZD2 基因對胰島素的產生以及胰島 β 細胞的存活起到調節的作用，BMP3 基因啟動子甲基化與人胃癌發生有關,以上靶基因在兩組人群中的表達情況有待深入研究。
