人類基因組的遺傳多樣性不僅為研究人類種族和群體的源流、進化和遷移提供生物學依據，而且可為研究疾病發生發展及臨床藥物和生物制品的研發提供幫助。通過建立永生細胞系來長期保存不同民族和群體的基因組，對于保存和利用中國不同民族遺傳資源具有重要的戰略意義[1].水族與仡佬族因其起源及所處地理位置的不同，并且歷史上有過瘧疾等傳染病流行，形成了與中國其他民族有所不同的基因多態性，如在 Y 染色體多態性、線粒體遺傳多態性和 ABO 血型分布及基因頻率上具有自身的特點，與其他民族有較大的遺傳差異[2 -4].目前中華民族永生細胞庫中還缺乏水族和仡佬族的永生細胞株[1].本研究采用人類皰疹病毒（ Epstein-Barrvirus,EBV） 轉化結合環孢霉素選擇方法，擬建立貴州省水族和仡佬族人群 B 淋巴細胞永生細胞株，并使其成為可連續傳代的淋巴母細胞（ LCLs） ,結果報告如下。
1 材料與方法
1. 1 材料 144 份水族和 124 份仡佬族人外周靜脈血樣分別采自貴州省三都水族自治縣和務川仡佬族苗族自治縣，對象均是本民族世居居民，至少是三代純系，健康狀況良好，相互之間無親緣關系，年齡為 18 ~60 歲，男女各半； 遵從知情同意和自愿參加原則，每個個體采集 5 mL 外周靜脈血，4 - 羥乙基呱嗪乙磺酸抗凝，常溫放置及運輸，于 24 ~ 48 h 內到達實驗室進行細胞轉化。
1. 2 主要試劑與儀器 1640 培養基、100 mmol / L丙酮酸鈉和 4 - 羥乙基呱嗪乙磺酸（ HEPES） （ 上海Hyclone 公司） ; 胎牛血清（ 美國 Gibco 公司） ; 淋巴細胞分離液 Ficoll（ 美國 PerkinElmer 公司） ; 環孢素A（ 美國 Sw iterzland 公司） ; 200 mol / L 谷氨酰胺（ 昆明醫學生物所） ,EB 病毒株 B-958 細胞（ 中國科學院昆明動物研究所） .倒置光學顯微鏡（ 日本 Nikon公司） ,CO2培養箱（ 美國 Thermo 公司） .
1. 3 永生細胞系建立1. 3. 1 EBV 轉化淋巴細胞 參考文獻[5]方法進行，EBV 懸液來自 B-958 細胞培養上清液，B-958 細胞饑餓培養 4 ~ 6 d,離心收集上清液，經 0. 22 μm過濾，獲得 EBV 液，取新鮮外周血 5 mL,與 5 mL1640 細 胞 洗 液 （ 含 有 200 U / mL 青 霉 素 和200 μg / mL 鏈 霉 素 ） 混 勻 后，2500 r / min 離 心30 min,吸取中間白色細胞層，懸浮于 1640 洗液中，1 000 r / min 離心 10 min,棄上清，加入 1 mL 1640全營養細胞培養液（ 含 20%胎牛血清、100 U /mL 青霉素、100 μg /mL 鏈霉素、2 mmol/L 谷氨酰胺、10 μmol / L 丙酮酸鈉、20 mmol / L HEPES ） 懸浮細胞，轉移到細胞培養瓶中，加入 4 mL EBV 懸液，置搖床，37 ℃，120 r/min 1 h,加入1640 全營養液至終體積 10 mL,并加入環孢素 A 達終濃度 2 μg /mL,置 37 ℃，CO2培養箱培養，并逐日觀察細胞的轉化及生長狀況。
1. 3. 2 細胞群體倍增時間測定 收集細胞，調整細胞密度，每瓶 1 × 105個細胞接種于 25 cm2培養瓶中，連續培養 7 d,每 24 h 取 3 瓶細胞計數，取平均數； 以培養時間（ d） 為橫坐標，細胞濃度為縱坐標，繪制細胞生長曲線，根據公式計算細胞的群體倍增時間，t = △t × lg2/（ lg Nt- lg N0） ,其中 Nt 為 t 時間的細胞數，N0為理論初始細胞數。
1. 3. 3 細胞凍存與復蘇 細胞凍存： 收集細胞，懸浮于凍存液里，吹打均勻，每支凍存管分裝 1 mL 懸浮細胞，凍存管依次在4 ℃、-20 ℃、-80 ℃冰箱各放置 1 h,最后放入液氮罐中，最終放入液氮冰箱永久保存。細胞復蘇： 取液氮中凍存細胞，迅速在37 ℃ ~ 38 ℃ 水中快速融化，用洗液洗滌 1 次，1 000 r / min離心 10 min,棄上清，細胞懸浮于 1640全營養培養液中。置 CO2培養箱培養。
1. 3. 4 支原體檢測 將細胞懸液 1 mL 及 2 mL 無支原體滅活小牛血清，加入 8 mL 預冷至 56 ℃左右的半流體支原體培養基中，充分混勻后，置于 36 ℃溫箱中培養，設置陽性及陰性對照，每隔 3 d 觀察 1次，持續觀察 21 d,支原體陽性判定參考文獻[1].
2 結 果
2. 1 EBV 轉化細胞及細胞形態學變化（ 圖 1） 光學顯微鏡下可見淋巴細胞在 EBV 感染后第 2 ~3 天起開始透亮，部分細胞由原來的圓形變為不規則形態，少部分細胞變形變大； 約 7 ~ 10 d 后，形態不規則的細胞變大，即淋巴母細胞化，可觀察到有更多形態各異的細胞（ 圖 1A） ; 細胞逐漸聚集生長，并出現轉化而形成的細胞聚集（ B 淋巴細胞克?。?,隨后細胞克隆逐漸增多增大，繼續培養 2 周后，肉眼可見到白色細胞團塊（ 圖 1B） .2. 2 轉化后細胞凍存復蘇及支原體污染狀況 細胞株約 5 ~7 d 可進行傳代； 所有細胞株均能持續傳代、凍存復蘇后，細胞均生長良好，隨機支原體檢測結果為陰性。建成水族人永生細胞株 138 株，仡佬族人 115 株，細胞轉化陽性率分別為 95. 8% 和92. 7% .
2. 3 細胞生長曲線和倍增時間 細胞生長曲線顯示，細胞培養的延遲期較短，很快進入細胞對數期，群體中快速增殖的細胞占優勢； 經過 5 d 時間，進入平臺期； 通過公式計算，細胞群體的倍增時間是48 h,表明細胞具有旺盛的生長能力。
3 討 論
由于在民族源流、自然選擇因素等方面的不同，水族和仡佬族人群呈現出與中國其他民族既有相似又有不同的遺傳多樣性特點。研究表明，貴州仡佬族等百越族群民族在單倍型上具有相似性，并可能與氐羌等其他民族發生過較大的基因融合，表現出百越與外族之間基因成分的互相交流[2].貴州少數民族線粒體多態性的研究表明，水族是一個古老的南方民族群體，總體表現出與壯族接近但又具有不同的特點[5]; 居于南方的仡佬族與具有北方起源的彝族有過廣泛的基因交流[4].調查表明，貴州水族群體在睫毛、拇指類型、中指毛 3 對遺傳性狀基因頻率與同地區的苗族有顯著性差異[6].水族和仡佬族人群在地中海貧血、6 - 磷酸葡萄糖脫氫酶（ G6PD） 缺乏癥等單基因遺傳性疾病及高血壓和糖尿病等復雜疾病的發病和流行等方面具有自己的特點。
EBV 可以使外周血 B 淋巴細胞轉化和分裂，成為永生性類淋巴母細胞，這一方法已被國內外廣泛用于各民族和群體的基因組保存[7].近年來多個采用全基因組測序方法的研究表明，EBV 轉化的淋巴細胞（ LCLs） 基因組與供體外周血細胞的基因組之間的差異非常微小，尤其是使用低代次的永生細胞將不會在遺傳多樣性和臨床疾病關聯基因等分析研究中產生有影響的偏差[7].永生化的細胞株不僅可以提供取之不竭的 DNA,還能提供 RNA 和蛋白質，并且由于具有活細胞的特性，還可以用于研究基因的功能、micoRNA 及基因表達調控及代謝途徑[8],同時還是研究病毒 - 宿主相互作用、藥物及其敏感/耐藥基因篩選、抗體和疫苗研究及干細胞研究等領域的重要材料[9 -10].
采用 EB 病毒轉化 B 淋巴細胞的方法已經建立多年，方法得到不斷優化和完善，關鍵技術環節包括從采集血液到實施細胞轉化的間隔時間、所需外周血體積、抗凝劑使用、T 淋巴細胞消除等[11 -13].本研究主要參照中國不同民族永生細胞庫建立的技術步驟[1],成功建立了 253 個水族和仡佬族人永生細胞株，轉化成功率分別為 95. 8% 和 92. 7%,未轉化成功的樣本多與所獲血液量少、血液樣本抗凝不充分而出現細胞凝集等因素有關。提示獲得足夠、新鮮血液樣本以保證足夠的淋巴細胞活性和數目是轉化實驗成功的關鍵因素之一。永生細胞株的建立還只是細胞庫的初期工作，還需對所建立細胞株進行進一步、持續性的質量檢測和細胞生物學特性分析，如染色體穩定性、端粒酶活性、B 淋巴細胞表面特異性分子標記及 B 細胞亞群分析等，以提供更多基礎科學數據和確保后續使用的可靠性。
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