肺纖維化是呼吸系統疾病發展至晚期的共同病理改變,造成肺功能不可逆的損傷,嚴重危害人類健康。目前研究認為,肺纖維化的基本病理過程包括早期彌漫性肺泡炎及后期大量間質細胞增生,發生基質膠原的進行性積聚以致逐漸取代正常的肺組織結構,嚴重影響肺的通氣和換氣功能。 在增生的細胞中,除肺泡上皮細胞和成肌細胞等外,成纖維細胞的增殖及活化并分泌基質膠原是纖維化形成的重要機制。 TGF-β1 被認為是誘導肺成纖維細胞活化的最重要的細胞因子,其作用的發揮與 β-catenin 途徑高度相關。 本研究通過觀察 β-catenin 蛋白敲除對TGF-β1 誘導的肺成纖維細胞的增殖及活性的影響,探討 β-catenin 蛋白敲除抗肺纖維化作用的細胞機制,為肺纖維化的治療提供新的思路。

1、 材料與方法

1.1 主要試劑及物品

大鼠肺成纖維細胞 \\(CCC-REPF-1\\),pcDNA3.0載體\\(Invitrogen\\),F-TrCP-Ecad 載體\\(鄭國平教授惠贈 \\),Lipofectamine2000 \\(Invitrogen\\),TGF-β1 \\(PeproTech\\),抗 E-cadherin,抗 α -SMA,抗 Fn\\( SantaCruz\\),FITC 標志的羊抗小鼠 IgG\\(武漢博士德生物工程有限公司\\),胎牛血清\\(中國杭州四季青\\),高糖 DMEM 培養基\\(GIBCO\\),TRIzol 總 RNA 提取試劑\\(武漢博士德生物工程有限公司\\),逆轉錄試劑盒\\(Promega\\),實時熒光定量試劑盒\\(上海生工生物工程技術服務有限公司\\),α-SMA 引物、colⅠ引物、colⅢ引物、GAPDH 引物\\(上海生工生物工程技術服務有限公司\\)。

1.2 肺成纖維細胞培養、傳代及分組

在體外培養的大鼠肺成纖維細胞\\(CCC-REPF-1\\),用含 10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的高糖 DMEM 培養基培養于 5%的 CO2,37℃人工培養箱中,細胞呈貼壁生長,進行傳代培養。細胞分組,分為正常細胞組、TGF-β1 刺激組、pcDNA3 轉染組、F-TrCP-Ecad 轉染組。

1.3 pcDNA3 及 F-TrCP-Ecad 轉染 CCC-REPF-1細胞

提取及純化重組質粒 DNA, 測 DNA 濃度備用。

取對數期細胞消化,調整細胞數為 2×105cells/L,接種12 孔板中,觀察細胞生長至 80%~90%時,棄培液,換無血清無雙抗培養基 800 μL,準備轉染。100 μL 無雙抗、胎牛血清的培養基中加入 4 ng 質粒,混合后置5 min, 共 6 個 EP 管,3 管為質粒 pcDNA3,3 管為質粒 F-TrCP-Ecad,100 μL 無雙抗、胎牛血清的培養基中加入 4 μL Lipofectamine2000 混合后置 5 min,6 個EP 管 ,將上述復合物混合后置 20 min,棄 12 孔 板 6孔的培養基,用無雙抗、胎牛血清的培養基清洗 2 次,加無雙抗、胎牛血清的培養基 800 μL,將上述復合物分別加入 6 個孔,前后晃置 4~6 h 換正常培養基。 轉染 6 h 換新鮮培養基,各組分別加入 TGF-β1\\(5 ng/mL\\),作用 48 h。

1.4 CCK-8 法檢測肺成纖維細胞增殖

將各組細胞調整細胞濃度至 5000 個/100 μL,以每孔 100 μL 接種于 96 孔板,每組復設 8 孔,每板每孔加入 CCK-8 10 μL,5%CO2孵育箱內繼續孵育 1h,分光光度計下測定 450 nm 波長處 OD 值。

1.5 Western 印跡檢測細胞中 E-cadherin、α-SMA、Fn的表達

取細胞用 PBS 洗滌后轉移到 EP 管,離心后棄上清,將收集到的細胞加細胞裂解液裂解 1 h 后,離心30 min,取上清,BCA 蛋白質定量法測定蛋白濃度,取等量蛋白 30 μL 行 SDS-PVDF 凝膠電泳, 轉膜至PVDF 膜,條件 4 ℃ 2~5 h,5%脫脂牛奶封閉 2 h。 在4 ℃下小鼠抗大鼠 E 鈣黏蛋白、α-SMA、 纖維連接蛋白單克隆抗體\\(稀釋為 1∶200\\)與膜接觸孵育過夜,用洗膜緩沖液\\(TBST\\)在脫色搖床下洗膜 5 min×5 次,加羊抗小鼠 IgG, 室溫下孵育 2 h 后,TBST 洗膜, 加入ECL 在 室溫下反應 5 min 后 成像 ,Taiphone 掃 描結果,采用 Gene Snap/Gene Tool 軟件分析以 GAPDH 蛋白為內參定量分析 E 鈣黏蛋白、α-SMA、纖維連接蛋白條帶相對灰度值。

1.6 總 RNA 抽提及實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應\\(Real-timePCR\\)

各組細胞每孔加入 500 μL TRIzol Reagent,按試劑盒說明提取總 RNA 及行 RT-PCR 檢測 α-SMA、colⅠ、col Ⅲ表達,GAPDH 為內參。

GAPDH 引 物序列 : 上游引物 5 ˊ - GGTGCT-GAGTATGTCGTGGAGT -3 ˊ 下 游 引 物 5 ˊ -CAGTCTTCTGAGTGGCAGTGAT -3,α -SMA 上 游引物 5ˊ- AGCCAGTCGCCATCAGGAAC -3ˊ下游引物5ˊ- GGGAGCATCATCCCAGCAA-3ˊ,colⅠ: 上游引物 5ˊ- GACATGTTCAGCTTTGTGTACCTC -3ˊ下游引物 5ˊ- GGGACCCTTAGGCCATTGTGA -3ˊcolⅢ:上游引物 5ˊ- TTTGGCACAGCAGTCCAATGTA -3ˊ下游引物 5ˊ-GACAGATCCCGAGTTCGCAGA -3ˊ。PCR 反 應體系條件 : 95℃ 20 s;95℃ 3 s,60℃ 30 s。

40 個循環。 由隨機附帶軟件計算出 Ct 值和拷貝數。

1.7 統計學方法

計量資料采用均數±標準差表示, 數據處理采用SPSS 19.0 軟件進行 t 檢驗或方差分析,P <0.05 為差異有統計學意義。

2、 結果

2.1 肺成纖維細胞光鏡下觀察

成纖維細胞呈梭型,有較長的突起,胞核呈卵圓形,位于細胞中央,成放射狀和柵欄狀排列。 TGF-β1刺激后,細胞體積明顯增大,胞突消失,細胞數量明顯增多,細胞間隙變小。F-TrCP-Ecad 轉染組大部分細胞呈梭型,有較長的突起,細胞間有明顯間隙。

2.2 CCK-8 法觀察各組肺成纖維細胞增殖與正常組比較, TGF-β1 刺激組、pcDNA3 轉染組其 OD 值明顯增高,但兩組比較,無統計學差異;F-TrCP-Ecad 轉染組 OD 值較 TGF-β1 刺激組明顯減低\\(P<0.01\\),與正常組比較無統計學差異。 見表 1。

2.3 Western 印跡法檢測各組細胞中 α-SMA、Fn、E-cadherin 的表達

與正常組比較, TGF-β1 刺激組、pcDNA3 轉染組其 α -SMA、Fn 蛋白表達顯著升高, E-cadherin 表達顯著降低 \\(P<0.01\\), 而兩組比較無統計學差異;F-TrCP-Ecad 轉染組較 TGF-β1 刺 激組 α -SMA、Fn 蛋白表達顯著降低,E-cadherin 表達顯著升高\\(P<0.01\\),與正常組比較無統計學差異。 見表 2。

2.4 熒光實時定量 RT-PCR 檢測 α-SMA、colⅠ、colⅢ表達

與正常組比較, TGF-β1 刺激組、pcDNA3 轉染組β-catenin 途徑 α -SMA,colⅠ,colⅢmRNA 表達增高\\(P<0.01\\), 而兩組比較無統計學差異 ,F-TrCP-Ecad轉染組較 TGF-β1 刺激組 α-SMA、colⅠ、colⅢ表達降低\\(P<0.01\\),與正常組比較無統計學差異。 見表 3。

3、 討論

肺成纖維細胞增殖與活性增強是肺纖維化發生的重要的致病過程,對其機制的研究并尋找新的治療靶點是目前研究的焦點。肺纖維化過程中在 TGF-β1刺激下使肺成纖維細胞不斷地增殖和轉型為肌成纖維細胞 \\(myofibroblast,MB\\)。 MB 是一種特殊階段的FB,能夠大量分泌 ECM,分泌能力是 FB 的 4~5倍 ,大量表達 α-SMA、Fn、I、III 型膠原,加速纖維化進程。

TGF-β1 是誘導肺成纖維細胞活化發生的最重要的生長因子,TGF-β1 發 揮作用的途徑包括 Smad、β-catenin 和非 Smad 通路, 其 β-catenin 途徑與疾病及纖維化形成的病理過程高度相關。 Vuga,et al發現 WNT5A 基因途徑在 IPF 的肺成纖維細胞較正常肺成纖維細胞有顯著地調節意義, 通過非經典的WNT / β-catenin 途 徑WNT5A 激 活顯著地誘導肺成纖維細胞增殖同時抑制細胞凋亡。 Chilosi 等報道了在特發性肺纖維化\\(IPF\\)患者受損支氣管基底細胞和損傷部位肺成纖維細胞中可見 β-catenin 向細胞核內轉移、積聚,提示 β-catenin 與肺纖維化及肺成纖維細胞活性的相關性,因此我們設想通過抑制 β-catenin功能可能對肺纖維化發揮治療作用。

F-TrCP-Ecad 質粒是 Cong等設計的 β-catenin靶向降解質粒,只降解細胞質中的 β-catenin 蛋白,而不破壞細胞膜上的 β-catenin 蛋白, 從而減少其向細胞核內的轉移,降低其轉錄活性。 本研究采用該載體轉染大鼠成纖維細胞, 觀察阻斷 β-catenin 途徑對肺成纖維細胞增殖及活性的影響。 結果顯示:TGF-β1刺激 48 h 后,成纖維細胞體積明顯增大,胞突消失,細胞數量明顯增多, 細胞間隙變小,F-TrCP-Ecad 轉染組大部分細胞呈梭型,有較長的突起,細胞間有明顯間隙。 CCK-8 法檢測 F-TrCP-Ecad 轉染組肺成纖維細胞增殖較 TGF-β1 刺激組明顯降低。 F-TrCP-Ecad 轉染組肺成纖維細胞間質細胞標志物 α -SMA、Fn 蛋白表達量明顯低于 TGF-β1 刺激組,E-cadherin表達量較 TGF-β1 刺激組增高。 F-TrCP-Ecad 轉染組大鼠肺成纖維細胞 β-catenin 途徑轉錄產物 α-SMA、colⅠ、colⅢ表達明顯降低, 證實 β-catenin 蛋白敲除通過降解細胞質中的 β-catenin 蛋白, 減少其向細胞核內的轉移抑制 TGF-β1 誘導的肺成纖維細胞增殖、活性增強,抑制纖維化進程。

綜上所述,TGF-β1 是促進肺成纖維細胞增殖、活化的重要細胞因子,β-catenin 途徑是 TGF-β1 發揮作用的重要信號通路,β-catenin 蛋白敲除載體\\(F-TrCP-Ecad 質粒\\)通過阻斷該信號途徑 ,阻斷成纖維細胞轉化為其活性形式肌成纖維細胞,同時抑制成纖維細胞釋放胞外基質,阻斷纖維化進程,從而能為肺纖維化疾病治療提供新的思路及實驗依據。