1 引言
為實現發酵過程的優化和控制，開發適用于該過程的新型傳感器和在線檢測技術十分關鍵。例如，葡萄糖生物傳感器是實現發酵液中葡萄糖濃度實時在線檢測的主要手段。生物傳感器工作時需要有生物活性物質的參與，這些活性物質不能經受高溫滅菌等無菌化處理。因此，如果沒有特殊裝置，生物傳感器不能直接連接反應器進行發酵液的在線測量，這是限制生物傳感器在線應用的主要技術障礙。
目前，葡萄糖濃度檢測主要采用離線方式，實現在線測定或聯機測定主要有兩種技術手段:原位測定和引流測定。原位測定將酶電極直接插入生物反應器，其優點是無時間延遲，無樣品損耗，儀器成本低，但傳感器極易受發酵液理化因素干擾，而且固定化酶無法經受高溫滅菌。引流測定技術是目前研究的熱點。
近20年來，已有多人設計過發酵液在線引流取樣裝置，并嘗試進行在線檢測，都存在一些問題。如張先恩等設計了盤式膜透析分離取樣裝置，采用醋酸纖維素濾膜透析法，由于受到透析膜兩邊壓差、液體停留時間、溫度等因素影響，不利于在實際生產中應用。同樣是透析原理的TＲACEAnalyticsGmbH生產的透析探頭要穩定一些，但仍然存在類似問題。vandeMerbel在做在線檢測發酵液的嘗試時，采用發酵罐外過濾取樣系統，其需要多路回流，系統復雜，且在發酵罐外，不利于滅菌。楊海麟等研制一套生物反應過程在線檢測系統，其取樣裝置采用膜過濾，其取樣速率過低\\(小于1mL/min\\)，若分析儀對樣品量要求較高，則不易滿足;與其類似的還有Flownamics公司開發的FISP系列取樣探頭和TＲACEAnalyticsGmbH生產的過濾探頭，兩者價格昂貴，取樣速率亦過低。本研究組設計了一種透析取樣裝置，并用于發酵過程葡萄糖在線檢測系統，實驗過程中亦發現葡萄糖通透性受溫度、壓差等因素干擾，不利于實際測量。
本研究設計了一種結構簡單，牢固耐用的陶瓷膜取樣探頭，用此探頭進行了發酵液的取樣測試，并對實驗結果進行分析。
2 實驗部分
2．1 過濾取樣裝置的設計
2．1．1 工作原理
引流測定是在發酵過程中將少許發酵液引出發酵罐，在罐外用酶電極、色譜法或光譜法等進行測定。如果葡萄糖分析儀采用生物傳感器，則生物傳感器不需要放在發酵罐內，避免了高溫滅菌對生物傳感器的破壞。為了防止在發酵過程中發酵液染菌，需要有膜隔離措施。常見的取樣方法有透析法、過濾法、電萃取法、膜萃取法等，其中只有前兩種比較適用于發酵過程。透析取樣是將發酵液中的葡萄糖分子通過透析膜擴散入存有緩沖液的擴散池內，然后將擴散池內含有葡萄糖的緩沖液引流出發酵罐進行測試。透析取樣的透過率受透析膜兩邊壓差、緩沖液停留時間、溫度等因素影響，難以確定葡萄糖在得到的樣品中的稀釋程度，不利于準確測量。過濾取樣，采用錯流過濾技術，利用膜件實現發酵液與細胞的分離，同時將分離后的液體樣品引出發酵罐進行分析檢測。
2．2．2 裝置結構
設計的用于發酵過程在線檢測的發酵液快速過濾取樣裝置包括支撐體、旋塞閥、O型圈、過濾膜管、管蓋，其中支撐體和管蓋用螺紋結構連接，兩者共同固定了過濾膜管，零件間采用密封膠密封;旋塞閥通過卡套連接支撐體的出液口，O型圈卡在支撐體相應的O型圈溝槽中。其結構如圖1所示。支撐體采用不銹鋼制作，可直接安裝在發酵罐上，其與發酵罐之間由O型圈密封。支撐體中心有導流孔，濾出液可以由此流出該裝置，經過旋塞閥進入測量分析儀器。使用時，先將支撐體固定在發酵罐上，然后連接旋塞閥。過濾膜管為圓管狀，套在支撐體較細一端的圓柱體外，兩者之間存在薄的縫隙。工作時，發酵液在過濾膜管的外邊流動，經錯流過濾滲透進縫隙中，然后流入支撐體中心的導流孔。
過濾膜管可采用耐高溫、孔徑0．1～0．2μm的陶瓷膜材料，發酵液經過過濾膜管的過濾，分離出了罐內微生物和固體顆粒，但過濾液和發酵液中葡萄糖、無機鹽等物質的濃度是一致的。同時，過濾膜管也阻斷了發酵罐外部的細菌等微生物通過取樣口進入發酵罐里的發酵液中，達到防止染菌的目的。管蓋采用不銹鋼制作，通過螺紋連接支撐體。使用本裝置時，可以安裝在發酵罐上，取樣口直接連接分析儀器的進樣口\\(儀器內有泵裝置\\)，取樣速率由分析儀控制，也可以進行離線取樣。取樣裝置僅有5個零部件，其中支撐體和管蓋的結構簡單，易于加工和批量化生產，其余零件均為標準件或可以直接購買選取，且價格低廉。因此裝置整體結構簡單，易于裝配和批量化生產，制作成本低。過濾膜管卡在支撐體與管蓋之間，又有密封膠粘緊密封，這樣的結構確保裝置整體牢固。過濾膜管可采用陶瓷膜，密封膠可采用耐高溫的環氧樹脂結構膠，選材能夠方便地達到耐高溫、耐腐蝕的要求，可以經受高溫高壓滅菌。過濾膜管套在支撐體外，過濾的有效面積較大，保證了在同樣壓力下，可以達到較高的取樣速度，當要求一定的取樣速率時，由分析儀根據需要調節蠕動泵即可。采用的過濾膜可以有效防止取樣時染菌，目前陶瓷膜孔徑可低于0．1μm。
2．2 材料與儀器
由山東省科學院生物研究所SBA系列分析儀專用緩沖劑添加蒸餾水配制的檢測用緩沖液。由市售分析純葡萄糖配制并在室溫下靜置6h的葡萄糖溶液。工業現場大腸桿菌發酵液樣品，在發酵期間臨時采集并水浴滅活。
OEMBJ60-01型蠕動泵\\(保定蘭格恒流泵有限公司\\)。過濾取樣裝置由本實驗組設計加工，過濾膜管采用凈易CM01-1775型濾芯\\(廣州凈易環?？萍加邢薰綷\)，支撐體和管蓋由不銹鋼加工，O型圈等零件為標準件，密封膠采用7102型耐高溫環氧樹脂結構膠，引流管采用特氟龍材料。SBA-40E葡萄糖生物傳感分析儀\\(山東省科學院生物研究所\\)。
3 結果與討論
3．1 取樣速率測試
分析儀對樣品的取樣量有限定，在單位時間內通過該裝置獲取的樣品量即為取樣速率。取樣速率與濾膜的通透性和液體的粘度、濃度及膜兩邊的壓差等有關。在測試取樣速率時，分別選用發酵液和不同濃度的葡萄糖溶液在不同的蠕動泵轉速下測試裝配取樣探頭時的取樣速率\\(圖2A\\)和去掉取樣探頭時的蠕動泵流速\\(圖2B\\)，通過對比，評價探頭的取樣速率。
實驗中選取的葡萄糖溶液濃度分別為0，1，2，5和10g/L。將取樣頭先后放入裝有不同濃度葡萄糖溶液和發酵液的燒杯中，保證取樣頭的過濾膜管全部沒入液體中，安裝好旋塞閥、待測液引流管、蠕動泵。測試過程中，變更蠕動泵的轉速分別為20，40和60r/min，測量不同轉速下穩定時引流管的液體流速，即取樣速率，數據如表1。
3．2 葡萄糖通透性測試
除了測試取樣速率外，還要測試抽取樣品中的葡萄糖濃度來評價探頭的葡萄糖通透性。在透析取樣中常采用透析后透析液的葡萄糖含量與總的葡萄糖含量\\(包括透析后透析液的葡萄糖含量與透析后原溶液的葡萄糖含量之和\\)的比值作為葡萄糖的透過率。由于采用超濾方法，故定義透過率為過濾后所獲樣品的葡萄糖濃度與取樣前待取樣液的葡萄糖濃度的比值。表2為穩定時葡萄糖通透性實驗的數據。
3．3 響應時間測試
取樣包括過濾和引流兩個環節，液體從探頭外部進入探頭，并經過引流裝置到分析儀，這需要一定的時間，并且在引流過程中，還會造成前后溶液的混合，因此需要進行時延測試。實驗測試時裝置的連接同圖3A，與過濾速率測量不同的是:將蠕動泵調至60r/min，先吸取蒸餾水一段時間，待取樣穩定后，迅速將蒸餾水更換為7．6g/L葡萄糖溶液，保持蠕動泵轉速不變，測量獲取的溶液樣品中葡萄糖含量隨時間的變化，結果如圖3所示。
3．4 過濾取樣裝置的特點
從取樣速率測試的結果可知，蠕動泵在不同轉速時，取樣速率會隨之線性變化，無論是否連接取樣探頭，或是改變葡萄糖溶液的濃度，其影響都不大。
可以認為在蠕動泵的不同轉速條件下，取樣探頭對不同濃度的葡萄糖溶液的阻礙作用均不明顯。這樣可根據需要調節蠕動泵的轉速來控制檢測時的取樣速率。傳統透析取樣的透過率受葡萄糖濃度、溫度、停留時間等影響很大［8］，本裝置的葡萄糖透過率基本為100%，對測試的誤差的貢獻幾乎為零。在對隨機選取的發酵液進行取樣測試時，雖然發酵液的組分、濃度和雜質含量較葡萄糖溶液復雜得多，但其測試結果與葡萄糖溶液測試結果十分相似，因此可以認為短期內取樣速率和透過率幾乎不受溶液的組分、濃度和雜質狀況的干擾。
在線引流測定，無論是透析取樣還是過濾取樣都會增加額外的時延，這主要是由于增加了管路，液體從發酵罐到儀器之間需要傳送時間，而透析取樣方法還需要額外的透析停留時間，以保證葡萄糖的通過率。0～1．5min所測的結果一直為零，這段時間是引流管造成的新樣本傳送時間。3～4min所測的結果已經接近實際值，之所以還略小于實際值，是由于在陶瓷膜管和支撐體之間所留的空間過大，一部分空間內殘存微量的上一時刻的液體稀釋了當前溶液，減小陶瓷膜管和支撐體之間所留的空間，可以使這段時間縮短。不考慮引流管造成的傳送時間，則取樣探頭的延時為2min\\(第1．5min到第3．5min\\)。
由于裝置所用材料均是耐高溫材料，在蒸氣滅菌環節不會被破壞。陶瓷膜的孔徑為0．1μm，絕大多數細菌的直徑在0．5～5．0μm之間，因此裝置能夠阻斷罐內和罐外的菌體來往，即使在發生故障出現液體逆流，外界細菌也無法侵入發酵罐。探頭外有大量的流動發酵液不斷沖洗過濾膜，并且蠕動泵所帶來的壓差并不大，故濃度極化層的影響很小，可以忽略，在一定程度上避免了濾膜的阻塞。
本研究設計的快速過濾取樣裝置能很好地應用于酶注射式葡萄糖生物傳感分析儀及其它類型的在線發酵液分析儀器，具有結構簡單，成本低廉，取樣速度快，取樣時無需太大壓差的特點。此裝置取樣速率較大，并可根據需要調節，葡萄糖透過率一直穩定在100%，時間延遲約2min，解決了染菌等問題，適于在發酵過程在線監控中應用。
