類固醇激素是一類由膽固醇衍生而來的具有內分泌干擾效應的物質。環境中類固醇激素的主要來源包括人及脊椎動物的排泄、人工合成含類固醇激素藥物的使用以及醫院或制藥廠廢水的排放[1-4].人類來源的類固醇激素主要通過污水處理廠處理后排入水體，動物來源的類固醇激素主要通過糞便排泄進入環境體[5-7].由于這類物質具有較強的生物活性，一旦進入水體就可能對非目標生物正常的內分泌功能產生干擾。有報道表明，長期暴露在低濃度的類固醇激素下會對魚類的生殖系統產生負面影響并導致雌性特征在雄性魚中出現[8-9].
類固醇激素在環境介質中殘留的準確測定是對其進行風險評價和污染防治的基礎。目前類固醇激素的分析有氣相色譜法、液相色譜法和酶聯免疫分析法等[10-12].由于類固醇激素在環境中的濃度通常較低，通常需要對樣品進行富集。目前主要采用的富集方法包括固相萃?。⊿PE）和固相微萃取法（SPME）[13-14].對于土壤及沉積物等固體樣品中類固醇激素的測定還需通過溶劑提取。超聲提?。║SE），加速溶劑提?。ˋSE）都有運用[15-16].本文采樣丹磺酰衍生化的方法提高類固醇激素的電離效率并結合固相萃取和加速溶劑萃取技術，建立了水體及土壤樣品中類固醇激素準確、靈敏的檢測方法。
1材料和方法
1.1儀器與試劑
Varian 1200LLC-MS/MS電噴霧（ESI）三重四級桿液相色譜質譜聯用儀（Varian公司，美國）。Di-onex ASE200加速溶劑萃取系統（Dionex公司，美國）。Nova Pack C18（150×4.6mm,4μm）色譜柱（Waters公司）。ENVI-18（6mL,500mg）和LC-18（3mL,500mg）固相萃取小柱（Supelco公司）。
標準物質孕酮（progesterone），醋酸美倫孕酮（melengestrol acetate），雌酚酮（estrone），17α-雌二醇（17α-estradiol），17β-雌二醇（17β-estradiol），雌三醇（estriol）和17α乙炔雌二醇（17α-ethinylestra-diol）購于Sigma公司。內標物質氘代17β-雌二醇（17β-estradiol-D3）和氘代雌三醇（estriol-D2）購于C/D/N Isotopes公司。分析純藥品和色譜純有機溶劑均購于Fisher公司。
1.2樣品采集
地表水樣品采自天然河道，用1L玻璃瓶保存，回實驗室后過0.7μm玻璃纖維濾膜并在4 ℃儲藏。表層土壤（0~20cm）樣品采自一植物園內，冷凍干燥后過篩（<0.2cm）并在-20℃儲藏。
1.3樣品前處理
水樣 用 固 相 萃 取 方 法 富 集。固 相 萃 取 小 柱（ENVI-18）先后用6mL丙酮和去離子水活化。取過濾后的水樣200mL,調節pH值到7,加入40μL濃度為500μg/L的內標后過固相萃取小柱，流速約為10mL/min.隨后用含20%丙酮的水溶液清洗。最后用6mL丙酮洗脫。洗脫液用高純氮氣吹干并進行衍生化。
土壤樣品用加速溶劑萃取法萃取。取過篩的土壤樣品5g,加入50μL濃度為500μg/L的內標，同硅藻土混合后裝入11mL萃取管，兩頭用玻璃纖維濾膜密封。優化的萃取條件為：丙酮，溫度60℃，壓力1500psi,預 熱5 min,加 熱5 min,淋 洗 體 積60%,吹掃時間2 min,循環2次。萃取液稀釋到200mL,然固相萃取方法進行凈化和富集，方法同水樣。
1.4衍生化用
100μL碳酸氫鈉溶液（0.1mol并用NaOH調節pH值至10.5）溶解氮氣吹干的樣品，加入100μL丹磺酰氯（1mg/L溶解于丙酮）。震蕩混合后置于60℃烘箱內，加熱3min.取出樣品，氮氣吹干并用0.4mL甲醇溶解，轉移到2mL樣品瓶，儲藏于-20℃待分析。
1.5儀器分析
色譜分析條件為：流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈，流量0.3mL/min.洗脫梯度為：0~5 min,流動相B由40%升至73%,5~25min,升至78%,25~27min升至100%,保持5min后降到40%并平衡6min.定量采用內標標準曲線法。
質譜為正離子模式，干燥氣體溫度300℃，屏蔽電壓150V,針電壓6 000 V,碰撞氣體壓力2.0mTorr.其他參數設置見表1.
2結果與討論
2.1固相萃取過程優化
水體中類固醇激素的提取，我們比較了兩種反相固相萃取小柱（ENVI-18和LC-18）的效率。反相吸附劑能夠從水體中吸附非極性的物質而對極性物質的吸附能力較弱。本文所研究的目標物質均為弱酸（pKa>10），水體的pH值可能會影響固相萃取對目標物質吸附的效率。因此，我們對比了pH值為3和7時兩種反相固相萃取小柱的回收率。結果顯示兩種固相萃取小柱在pH值為3和7時均能獲得>80%的回收率（圖1）。兩種小柱和不同pH值的萃取效率無顯著性差異。結果表明所研究類固醇激素極性較弱，即使在中性條件下仍以分子形式存在?？紤]到酸性條件會增加水體中酸性物質的吸附，從而增加樣品中基質含量[17],因此選取pH值為7作為固相萃取條件。此外，LC-18小柱在萃取過程中較易堵塞，從而降低流速，所以選擇ENVI-18小柱進行進一步研究。
2.2溶液清洗優化
在用LC-MS/MS分析時，化合物的電離效率極易受到樣品中基質的影響[18].為了減小基質效應，我們試圖用一定比例的丙酮水溶液清洗固相萃取小柱。結果顯示當丙酮含量不超過20%時不會對目標物質的回收率產生顯著影響（圖2）。因此，選擇用含20%丙酮的水溶液清洗固相萃取小柱來凈化樣品。
2.3加速溶劑萃取優化
土壤中類固醇激素的分析需要先將目標物質從土壤中萃取出來。加速溶劑萃取技術是利用高溫高壓條件提高萃取效率。本文研究了不同溶劑和溫度對萃取回收率的影響。結果表明丙酮比甲醇具有更好的萃取效率（圖3）。高溫條件通?？梢蕴岣咻腿⌒?，但目標物質的回收率在100 ℃的回收率反而低于60℃。這可能是因為高溫時，更多基質被引入樣品，增加了基質的影響，也可能是在高溫條件下，目標物質發生降解。根據結果，選擇丙酮為萃取溶劑，60℃為萃取溫度進行試驗。
2.4衍生化過程優化
所選類固醇激素極性較弱，導致這些物質在ESI LC-MS/MS分析過程中電離效率較低從而影響到檢測的靈敏度[19].通過丹磺酰衍生化反應引入極性基團可以大大提高電離效率從而提高檢測的靈敏度。孕酮和醋酸美倫孕酮不具有活性基團，不發生反應。其他類固醇激素中的活性羥基中的氫被丹磺?；〈?。本文研究了衍生化試劑的用量以及類固醇激素的濃度對衍生化效果的影響。結果表明衍生化使得類固醇激素在儀器上的響應提高5~10倍（圖4）。當類固醇激素的濃度低于100μg/L時，100μL衍生化試劑的效果略好于200μL衍生化試劑的效果。但當類固醇激素的濃度達到200μg/L時，200μL衍生化試劑的效果較好。這可能是因為在較低濃度時，100μL和200μL衍生化試劑均能到達較高的衍生化效率，但200μL衍生化試劑會引入 更多的雜質從而影響信號的強度。但在高濃度時，100μL衍生化試劑的衍生化效率可能不完全?？紤]到環境中類固醇激素的殘留濃度通常在ng/L量級，濃縮后也在幾個到幾十個μg/L量級，因此選取100μL衍生化試劑進行衍生化。
2.5線性關系和方法檢出限
將標準品逐級稀釋配置成濃度為1,5,10,50,100,200,500μg/L的溶液。在優化的條件下進行測定。通過對測得結果進行線性擬合，相關系數（r2）優于0.998（表2）。說明在所測濃度范圍內，儀器相應與濃度呈線性關系。方法檢出限為能產生3倍信噪比（s/n=3）的最小樣品濃度。水體和土壤中目標物質的方法檢出限分別為0.02~0.6ng/L和0.01~0.18ng/g（表2）。
2.6準確度和精密度
按照優化試驗條件，將已知濃度的類固醇激素標準溶液加入200mL地表水樣品中，進行加標回收率試驗，試驗重復三次。數據見表2,水體中平均回收率為77% ~97%,相對標準偏差為1.0%~6.0%.土壤中平均回收率為62%~119%,相對標準偏差（RSD）為0.8%~15.5%.試驗數據表明該方法準確度與精密度均較好。與以發表的類固醇激素分析方法相比[19-20],本方法具有較高的分析靈敏度。
2.7空白和環境樣品分析
環境水樣采自武漢市區及周邊的地表水體。土壤樣品采自接受畜禽糞便改良的農田表層土。用去離子水和來自植物園的表層土做空白。按本方法分析?？瞻字形礄z測出目標物質。地表水樣品中除醋酸美倫孕酮和17α-乙炔雌二醇外均被檢出，總類固醇激素的濃度范圍為5.8~42.5ng/L.土壤中檢出17α-雌二醇，17β-雌二醇和雌酚酮，其濃度范圍為0.2~2.8ng/g.
3結論
建立了水體及土壤中類固醇激素的液相色譜質譜分析方法。通過丹磺酰氯衍生化大大提高了分析方法的靈敏度。樣品前處理過程的優化使得該方法具有較高的準確度和精密度。該方法適用于環境水體及土壤中類固醇激素殘留的分析。
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