1 引 言
人生長激素（ Human growth hormone,hGH） 是由腦垂體前葉嗜酸性細胞分泌的蛋白質，是一種肽類激素，是診斷巨人癥、肢端肥大癥、遺傳性生長激素生成缺陷所致的生長激素缺乏癥最常用的指標[1].
目前，臨床檢驗中針對重組 hGH （ rhGH） 的檢測方法有酶聯免疫法[2,3]、時間分辨熒光免疫分析法[4]、LC-MS/MS 法[5,6]、毛細管電泳結合紫外和質譜技術[7]也為檢測 rhGH 濫用后的濃度的差異提供了新途徑。但這些方法都是相對測定法，耗時長、費用高、操作復雜。因此，亟需建立具有操作簡單，高準確度和高精密度 hGH 的參考測量方法。
目前，純蛋白的定量方法主要有氨基酸分析[8]、質量平衡[9]、定量核磁[10]、質譜法[11]以及同位素稀釋質譜法[12,13].氨基酸分析法一般在氨基酸分析儀上通過紫外或熒光檢測，因此易受干擾，操作比較復雜； 質量平衡法雖然具有高準確度，但其在標準物質定值方面具有一定的局限性； 定量核磁法具有無需待測物對照品、樣品預處理步驟簡單、測定快速準確、專屬性強、不破壞樣品等優點，但靈敏度較低； 同位素稀釋質譜法具有操作簡單，高準確度和高精密度的特點[13].
本研究采用快速蛋白液相色譜分離純化 hGH,再采用 SDS-PAGE 和超高分辨能力 FTICR 對 hGH 進行純度表征和分子量測定，為蛋白質結構的鑒定奠定基礎。采用 KINETEX C18色譜柱在5 min 內快速分離 3 種氨基酸（ 脯氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸） .本方法具有操作簡易、分析速度快、重現性較好、實用性強等特點，并且準確可靠。以此為基礎建立了 hGH 的 HPLC-IDMS 聯用高準確度絕對定量方法。
2 實驗部分
2. 1 儀器、試劑與樣品
Qtrap 5500（ 美國 AB 公司） ; Agilent 1200 （ 美國安捷倫公司） ; 垂直電泳槽（ 美國伯樂公司） ; AKTApurifier （ 美國 GE 公司） ; 12 T-FTICR 高分辨率質譜儀 （ 美國 Bruker 公司） ; ME235S 型天平 （ 感量0. 01 mg,德國 Satorius 公司） ; RC10-22T 型離心干燥機（ 美國 Thermo 公司） ; UFE500 烘箱（ 德國 Mem-mert 公司） ; 移液器（ 10 ”L,20 “L,100 ”L,200 “L,1000 ”L,法國 Gilson 公司） ; 美國 Milli-Q 超純水系統。
標記氨基酸（13C5-脯氨酸、13C5-纈氨酸、13C9-苯丙氨酸，美國劍橋同位素實驗室） ; 脯氨酸（ GBW（ E）100084,Pro） 、纈氨酸（ GBW（ E） 100055,Val） 、苯丙氨酸（ GBW（ E） 100061,Phe） 國家標準物質（ 中國計量科學研究院） ; hGH（ 安徽安科生物工程股份有限公司） ; 三氟乙酸（ TFA,中國 DikmaPure 公司） ; 乙腈（ 美國 J. T Baker 公司） ; 蛋白質預制膠（ 7 × 8 cm,膠厚 1. 0 mm,美國伯樂公司） ; 10 × SDS 緩沖溶液（ 北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司） ; 彩虹預染寬分子量蛋白 Marker（ 10 ~260 kDa,中國中科瑞泰公司） ;其它試劑均為分析純。實驗用水為 Milli-Q 超純水。
2. 2 hGH 純化
將 1 mg hGH 溶于 1 mL 水中，經 0. 45 μm 濾膜過濾。將 1 mg/mL hGH 溶液，用 AKTA purifierHPLC 系統的 Jupiter C4色譜柱 （ 150 mm × 4. 6 mm,5 μm,Phenomenex,USA） 分離，柱溫設為60℃； 流動相 A: H2O （ 含0. 1% TFA） 和流動相 B: CH3CN（ 含0. 1% TFA） ,流速為 1 mL / min,紫外檢測器波長215 nm,分析時間 30 min,進行梯度洗脫，收集洗脫峰； 收集的洗脫峰濃縮干燥后用 0. 1% 甲酸復溶，進行蛋白質分子量及純度的鑒定。
2. 3 hGH 基本性質表征
2. 3. 1 SDS-PAGE 純度測定 冷凍干燥后，用洗脫峰收集液鑒定蛋白純度。分析條件： 在垂直電泳槽內放入蛋白質預制膠，并加入 1 × 電泳緩沖液，使其被充分浸泡。在 1. 5 mL 離心管中以體積比 50∶ 20加入 hGH 樣品和上樣緩沖液，然后在 100℃水浴鍋中煮沸 5 min,取出靜置。從！20℃取出 Bio-Rad 雙色蛋白 Marker,放至室溫，離心待用。在蛋白預制膠的每個孔中上樣 10 “L,電泳分析。電泳條件為電壓100 V,分離時間為 90 min.分析結束后剝離凝膠用考馬斯亮藍染色 1 h,加脫色液（ 水-甲醇-冰醋酸，5∶ 4∶ 1,V / V / V） 過夜脫色。
2. 3. 2 FTICR-MS 分子量測定 FTICR-MS 配有 12. 0 T 超導磁體和電噴霧離子化源（ ESI+） ,檢測范圍 m/z 200 ~3000.冷凍干燥后的純化蛋白用 0. 1%甲酸配制 0. 1 mg/mL hGH 溶液，取 500 ”L hGH 溶液，泵流速 10 “L/min,數據采集內存 2 M,256 次掃描，內標質量校正。分子量平行測定 6 次。
2. 4 HPLC-IDMS 法測定 hGH 蛋白質含量
2. 4. 1 標準溶液配制 準確稱取 10 mg 脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸標準物質（ 準確至 0. 00001 g） ,分別溶于 10 mL 1% 甲酸中，配制成標準工作溶液，使用時用 1% 甲酸稀釋 10 倍后使用。準確稱取 10 mg 同位素標記脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸（ 準確至0. 00001 g） ,分別溶于 10 mL 1% 甲酸-水中，配制成標記標準儲備液。同時配制脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸含量與樣品中脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸含量接近（ 約 1∶ 1） 的標準溶液，經 0. 22 ”m 濾膜過濾后，用 HPLC-MS 分析。
2. 4. 2 hGH 樣品的水解 稱取 hGH 樣品約 10 mg,溶于 10 mL 水中，配成 1 mg /mL hGH 溶液。分別取 200 “L hGH 溶液和標記氨基酸混合標準溶液，加到 2 mL 安瓿瓶中，真空離心干燥 30 min,取出后加入 500 ”L 6 mol/L HCl,通氮 2 min 除氧后密封，在 110℃的烘箱中進行水解，每隔 12 h 渦旋混勻 1 次。水解后用氮氣吹干，用 500 “L 0. 1% HCl 復溶，經 0. 22 ”m 濾膜過濾后進行測定。
2. 4. 3 HPLC-IDMS 分析 采用 KINETEX C18色譜柱 （ 150 mm ×2 mm I. D. ,2. 6 “m; 美國 Phenome-nex 公司） .以 0. 1% TFA-乙腈 （ 90∶ 10,V / V） 等梯度洗脫 5 min,流速 200 ”L / min.質譜儀噴霧電壓5. 0 kV; 殼氣流速 2 MPa; 輔助氣流速 0. 5 MPa; 干燥氣溫度 550℃ ; 碰撞能力 25.采用多反應檢測模式（ MRM） ,分別監測如下離子反應對： 脯氨酸： 116->70（ Pro） ,121->74（ 標記 Pro） ; 纈氨酸： 118->72（ Val） ,123->76（ 標記 Val） ; 苯丙氨酸： 166->120（ Phe） ,175->128（ 標記 Phe） .
