1 引 言

咖啡酸（ Caffeic acid） ,化學名為 3-（ 3,4-二羥苯基） -2-丙烯酸或 3,4-二羥基肉桂酸，屬于酚酸類化合物，廣泛存在于許多植物中，如菊科植物，薔薇科植物以及食物中[1].咖啡酸具有抗炎和免疫調節作用[2,3].此外，咖啡酸無論是在體內還是體外均具有抗氧化能力，能夠清除自由基和抑制脂質過氧化[4].現已報道的咖啡酸含量測定方法主要有高效液相色譜[5]、咖啡酸印跡石英晶體微納米傳感器[6]、電化學[7]、高效薄層色譜[8]和化學發光等[9].

氧化鋅納米顆粒（ ZnO NPs） 是一種重要的半導體納米材料，廣泛應用于光催化、光學和電子學等領域[10 ~12].許多文獻報道了將 ZnO NPs 應用于化學發光中，如 Li 等[13]研究發現，ZnO NPs 能增強魯米諾（ Luminol） -H2O2化學發光。Biparva 等[14]將 Luminol-H2O2-ZnO NPs 體系應用于測定制藥配方中的卡維地洛，取得較好的結果。在報道中，ZnO NPs 催化 H2O2分解，增強 Luminol 化學發光。但是 H2O2本身就是一種強氧化劑，能直接與 Luminol 發生反應，且易分解，使得實驗背景值大和發光信號不穩定。

研究發現，在 ZnO NPs 和 EDTA 存在的條件下，無需 H2O2等氧化劑的參與，Luminol 也能產生很強的化學發光，從而建立了一種新的化學發光體系 Luminol-EDTA-ZnO NPs.EDTA 是一種二鈉鹽，具有很好的穩定性，使化學發光信號穩定。EDTA 自身不具有氧化性，不能氧化 Luminol 化學發光，體系背景值低。本實驗中基于咖啡酸能夠有效抑制 Luminol-EDTA-ZnO NPs 化學發光，建立了流動注射化學發光法測定藥片中咖啡酸的含量。本方法具有簡單、快速、線性范圍寬和靈敏度高等特點。通常情況下，化學發光體系中的納米顆粒催化活性與它們的粒徑大小[13]、表面狀態[15]、形貌[16]等有關，因此本研究考察了不同粒徑的 ZnO NPs 對 Luminol-EDTA-ZnO NPs 體系化學發光的影響。

2 實驗部分

2. 1 儀器與試劑

IFFM-E 型流動注射化學發光分析儀（ 西安瑞邁分析儀器有限公司） ; UV-2450 紫外-可見分光光度計、電子天平（ 日本 SHIMADZU 公司） ; 數顯恒溫磁力攪拌器（ 金壇市雙捷實驗儀器廠） ; GL-16A 高速冷凍離心機（ 上海菲洽爾分析儀器有限公司） ; KQ-100B 型超聲波清洗器（ 昆山市超聲儀器有限公司） ;DELTA320 pH 計（ 梅特勒-托利多儀器有限公司） ; 艾柯 DZG-303A 純水制備儀（ 成都唐氏康寧科技發展有限公司） ; ZEISS Libra200 透射電鏡（ 德國 ZEISS 公司） .魯米諾（ Aladdin 公司） ; 甲醇 （ 分析純，重慶川東化工有限公司） ; EDTA、Na2CO3、NaHCO3、無水乙醇、Zn（ Ac）2·2H2O 和 NaOH（ 分析純，成都市科龍化工試劑廠） ; 實驗用水為去離子水。

2. 2 標準溶液的配制

準確稱取 0. 4429 g 魯米諾，用 0. 1 mol/L NaOH 溶液溶解并定容至 250 mL 棕色容量瓶中，配制成10 mmol / L 魯米諾儲備液，在 4℃ 下避光保存，放置 7 天后使用。根據需要，用 0. 1 mol / L Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液（ pH 10. 40） 稀釋成所需濃度，即配即用。

2. 3 ZnO NPs 的制備

參照文獻方法并略有改動，制備了不同粒徑的 ZnO NPs.

方法一[17],稱取 3. 2927 g Zn（ Ac）2·2H2O （ 0. 03 mol） ,溶于 100 mL 甲醇溶液。在室溫常壓下，超聲 10 min,得到澄清透明的溶液。將溶液轉移到圓底燒瓶中，在反應溫度 60℃下冷凝回流，用磁力攪拌器不斷攪拌，反應24 h,反應結束后冷卻到室溫。1300 r/min 離心分離 10 min.先用甲醇洗滌除去副產物，再用水洗滌甲醇，得到單相 ZnO NPs.重復實驗，制備一定量的 ZnO NPs,得到第 1 種 ZnO NPs.

方法二[18]: 取等量 100 mL Zn2 +溶液和 NaOH 溶液，分別加入 150 mL 含有分散劑的水中，反應溫度為 20℃，加入的速度控制在 0. 28 ~1. 1 mL/min,并且不斷攪拌。待加入反應試劑后，用蒸餾水洗滌白色沉淀，分散。通過改變滴加的速度，得到第 2 種和第 3 種 ZnO NPs.

方法三[19] : 分別配制 0. 1 mol/L Zn（ Ac）2·2H2O 和 0. 2 mol / L NaOH-乙醇溶液 50 mL,水浴溶解待用。將溶解完全的 NaOH-乙醇溶液放入 0℃冰水中降溫至同等溫度，然后在 0℃下磁力攪拌，緩慢滴加同體積的乙酸鋅醇溶液中，形成透明氧化鋅溶膠。滴加完畢，繼續在 20℃下保溫反應 0. 5 h,取出，加入適量的蒸餾水提純溶膠，溶膠沉淀出絮狀氧化鋅，室溫下離心分離后，洗滌數次，室溫下干燥得到納米氧化鋅粉體，得到第 4 種 ZnO NPs.

2. 4 化學發光的測定

采用圖 1 所示流路研究 Luminol-EDTA-ZnO NPs 體系的化學發光，并測定咖啡酸片中咖啡酸的含量。實驗條件： 0. 20 mmol/L EDTA,0. 2 mmol/L Luminol,pH 10. 20,0. 20 g/L ZnO NPs.

3 結果與討論

3. 1 ZnO NPs 的表征

通過 3 種制備方法得到了 4 種不同的 ZnO NPs,電鏡圖（ 圖 2） 顯示，4 種 ZnO NPs 形狀均為球形，第 1 ~ 第 4 種 ZnO NPs 粒徑分別約為 36,80,120 和10 nm,對 4 種 ZnO NPs 進行了紫外吸收光譜測定，其結果如圖 3 所示。第 1,第 2 和第 4 種 ZnO NPs 的最大吸收峰都在 360 nm 處，而第 3 種 ZnO NPs 沒有出現紫外吸收峰。單分散納米顆粒的吸收峰的半寬峰較窄，多分散納米顆粒則會在長波長方向出現吸收峰拖尾，由此可以說明，第 1 和第 2 種 ZnO NPs 在水中的分散性比第 3 和 4 種 ZnO NPs 更好。

3. 2 不同 ZnO NPs 對化學發光的影響

不同的 ZnO NPs 對化學發光的影響結果見圖 4.對于第1、第2 和第3 種 ZnO NPs,隨著 ZnO NPs 粒徑增大，ZnO NPs 對化學發光的增強作用逐漸減弱，可能的原因是 ZnO NPs 的粒徑對 ZnO NPs 的增強作用有一定影響，粒徑較小的 ZnO NPs 對化學發光的催化作用更強。第 4 種 ZnO NPs 粒徑約為 10 nm,是 4 種 ZnO NPs 中粒徑最小的，它對化學發光的增強作用最弱，可能的原因是第4 種 ZnO NPs 在水中的分散性不好，容易發生聚集，不能形成均一的分散體系，降低了 ZnO NPs 的催化活性面，從而降低了 ZnO NPs 的催化活性。實驗結果表明，ZnO NPs 粒徑和分散性均會影響其催化活性，粒徑越小，分散性越好，催化活性越強。

3. 3 實驗條件的選擇

在咖啡酸存在的條件下，考察了各反應條件對相對發光強度 ΔI（ 加入咖啡酸后的化學發光強度為I,空白的化學發光強度為 I0,ΔI = I0- I） 的影響，其結果見圖 5.圖 5A 顯示了 ZnO NPs 質量濃度對 ΔI的影響，ZnO NPs 質量濃度范圍在 0. 025 ~0. 20 g/L 時，ΔI 隨著 ZnO NPs 濃度增大而增加，在 ZnO NPs質量濃度到達 0. 20 g/L 時，ΔI 達到最大； 當 ZnO NPs 質量濃度大于 0. 20 g/L 時，ΔI 隨著 ZnO NPs 質量濃度的增大而變小。Luminol 濃度對 ΔI 的影響見圖 5B,Luminol 濃度范圍在 0. 04 ~0. 20 mmol/L 時，ΔI隨著 Luminol 濃度增加而迅速增大，Luminol 濃度大于 0. 20 mmol/L 時，ΔI 隨著濃度的增大而增加得比較緩慢。pH 值對 ΔI 的影響如圖 5C 所示，pH 在 9. 20 ~ 10. 20 范圍時，ΔI 隨著 pH 值的增加而不斷增大，當 pH =10. 20,ΔI 變化不大，趨于平穩。EDTA 濃度對 ΔI 的影響如圖 5D 所示，ΔI 隨 EDTA 濃度的增大而增加。當 EDTA 的濃度達到 0. 20 mmol/L 時，ΔI 的值達到最大，并保持基本不變。因此，Lumi-nol-EDTA-ZnO NPs 發光體系各物質的合適濃度為： 0. 20 mmol / L EDTA,0. 20 mmol / L Luminol,pH 10.20,0. 20 g / L ZnO NPs.

3. 4 咖啡酸的測定

3. 4. 1 線性范圍、檢出限和重現性 在優化的條件下測定咖啡酸片中咖啡酸的含量?？Х人釢舛鹊膶担?lgc） 和相對發光強度 ΔI 分段呈良好的線性關系，咖啡酸濃度在 1. 0 ×10!7~ 1. 0 × 10!6mol / L 范圍內，其線性回歸方程為 ΔI = 158. 2lgc + 12417. 9（ r = 0. 9987） ; 咖啡酸濃度在 1. 0 × 10!6~ 1. 0 ×10!5mol / L 范圍內，其線性回歸方程為 ΔI = 259. 5lgc + 4405. 2（ r = 0. 9970） .根據 IUPAC（ 3σ） 規定，計算得方法的檢出限（ LOD） 為 1. 8 × 10!8mol / L.平行測定濃度為 4. 0 × 10!7mol / L 的咖啡酸標準溶液11 次，其 RSD 為 3. 5% .與其它采用測定咖啡酸的文獻相比（ 表 1） ,本方法能夠獲得較低的檢出限和較寬的線性范圍，并且使用 Luminol-EDTA-ZnO NPs 流動注射化學發光的方法具有簡單、快捷、穩定、重現性好等特點。

3. 4. 2 干擾實驗 在選定的實驗條件下，考察了多種物質對 4. 0 × 10!7mol / L 咖啡酸發光強度的影響，當以相對誤差為 ±5% 作為干擾水平上限時，其結果表明： 1000 倍的 Na+,K+,Cl!; 800 倍的 HCO2!3,SO2!4,CO2!3,Ca2 +; 500 倍的乙醇、淀粉、葡萄糖； 400 倍的檸檬酸、環糊精均不干擾測定。

3. 4. 3 樣品測定 取市售的咖啡酸片劑5片（ 標示量： 0. 1g / 片） ,準確稱量，研細均勻。取0 . 0250 g咖啡酸粉末，以水溶解并定容至 100 mL,以此為待測樣品，采用標準加入法進行回收率測定，回收率在 97% ~101%之間（ 表 2） .測得咖啡酸片劑中咖啡酸含量為 0. 0998 ±0. 0021 g/片，與標示量一致。

研究結果表明，Luminol-EDTA-ZnO NPs 法具有簡單、快捷、穩定、重現性好等特點。