石榴\\(Punica granatum L.\\)為石榴科\\(Punicaceae\\)石榴屬植物,原產于中亞,在我國已有近 2000 年的栽培歷史,且品種繁多,主要分布在以下地區,即陜西臨潼、山東棗莊、安徽懷遠、四川、云南和新疆等地區.目前,石榴的加工產品形式主要為汁和酒,石榴籽大多以廢料棄之.然而研究表明,石榴籽油具有延緩衰老、預防動脈硬化和冠心病的功效,也具有抗癌和調節免疫等作用[1-3];石榴籽蛋白質含量豐富,氨基酸組成較完全[4];多酚是石榴中最普遍的一類化學成分,在石榴籽中含量雖小,但其提取物是一類強抗氧化劑[5].據現有文獻報道,對石榴籽的脂肪酸、蛋白質和多酚類物質已有研究,但其品種間的差異性研究較少.為此,本文以陜西臨潼產區的白色甜味、紅色甜味和紅色酸味3 種果實特點,選取"三白甜"、"凈皮甜"和"酸石榴"3個栽培品種,研究其籽油的脂肪酸組成、石榴籽氨基酸組分及多酚組分,并比較 3 個品種之間的差異性,為石榴籽的開發和認識提供理論基礎.

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

"三白甜"、"凈皮甜"和"酸石榴"石榴成熟果實:購于陜西臨潼.石油醚\\(60 ℃~90 ℃\\)、氫氧化鉀、甲醇、乙醇、沒食子酸、福林酚、槲皮素、三氯化鋁、香草醛、鞣酸、鎢酸鈉、磷鉬酸、磷酸、碳酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、硼酸、濃硫酸等試劑均為分析純;多酚標準品和氨基酸標準品:均為色譜純.

1.2 儀器與設備

BL6-180A 型超聲波清洗機:上海比郎儀器有限公司;QP2010 型氣相色譜-質譜聯用儀:日本島津公司,色譜柱為 30 m×0.25 mm×0.25 μm 的毛細管柱;7230G 可見分光光度計:上海精密科學有限公司;HH-S4 型電熱恒溫水浴鍋:北京科偉永興儀器有限公司;PHS-3C 型 pH 計:上海精密科學有限公司;K9840 自動凱氏定氮儀:濟南海能儀器有限公司;SH220 石墨消解儀:濟南海能儀器有限公司;LC-20A 高效液相色譜儀:日本島津公司;L-8900 全自動氨基酸分析儀:日本日立公司.

1.3 方法

1.3.1 樣品的前處理

每個栽培品種的鮮石榴手工剝皮、榨汁后得石榴籽,將石榴籽除雜、洗凈,在 50 ℃烘至恒重,得石榴籽,密閉儲存于陰涼干燥處待用.試驗前將石榴籽粉碎,過 60 目篩,得石榴籽粉,用于測定蛋白質和多酚的石榴籽粉在使用前需脫脂.

1.3.2 3 種石榴籽的脂肪、蛋白質和多酚的含量測定粗脂肪含量的測定:GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的測定》中索氏抽提法;蛋白質含量的測定:GB5009.5-2010 《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法;石榴籽多酚的提取[6-7];總酚含量測定[8];總黃酮含量測定[9];總單寧含量測定[10];原花色素含量的測定[11].

1.3.3 3 種石榴籽的脂肪酸、氨基酸和多酚組分分析1.3.3.1 脂肪酸組成成分分析采用日本島津公司 QP2010 型氣相色譜-質譜儀進行分析,色譜柱為 30 m×0.25 mm×0.25 μm 的毛細管柱,內涂 SE-54.

1\\)甲酯化方法[12-13]稱取 20mg 石榴籽油,置于具塞試管中,加入1.5mL石油醚\\(30 ℃~60 ℃\\)與苯\\(1︰1,體積比\\)的混合液,振搖使油脂溶解后,加入 2 mL 的 0.4 mol/L 的 KOH-甲醇溶液,混勻后在室溫下靜置 10 min,再加入 12 mL水,靜置取上清液,進行色譜分析.

2\\)氣相色譜-質譜分析條件[12-15]載氣\\(He\\),流速 1.0 mL/min,壓力 109.8 kPa,進樣量 1 μL;進樣溫度:250 ℃;接口溫度:270 ℃;升溫程序:從 150 ℃開始,以 10 ℃/min 升至 220 ℃,再從 220 ℃以 8 ℃/min 升至 300 ℃,300 ℃保持 3 min;分流比60 ∶ 1.質譜電離方式 EI;離子源溫度 200 ℃;電子能量70 eV;加速電壓 6 kV;分辨率 800;質量掃描范圍40 m/z~500 m/z;溶劑延時 3 min.

1.3.3.2 蛋白質中氨基酸組分分析蛋白質中氨基酸組分分析:GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的測定》.

1\\)水解稱取 0.1 g 脫脂后的石榴籽粉于水解管內,加6 mol/L 的鹽酸 10 mL,再加入新蒸餾的苯酚 3 滴~4滴,將水解管放入冷凍劑中,冷凍 3 min~5 min,再接到真空泵的抽氣管上,抽真空\\(接近 0 Pa\\),然后充入高純氮氣,再抽真空充氮氣,重復 3 次,在充氮氣狀態下封口并將水解管放在\\(110±1\\)℃的恒溫干燥箱內,水解 22 h后,取出冷卻.打開水解管,將水解液過濾后,用去離子水多次沖洗水解管,將水解液全部轉移到 50 mL 容量瓶內并用去離子水定容,吸取濾液 1 mL 于 5 mL 容量瓶中,用真空干燥器在 40 ℃~50 ℃干燥,殘留物用 1 mL~2 mL水溶解,再干燥,反復進行 2 次,最后蒸干,用 1 mL pH2.2 的緩沖液溶解,供儀器測定用.

2\\)測定使用濃度為 0.1 μmol/mL 的混合氨基酸標準溶液作為上機測定用的氨基酸標準液,用氨基酸自動分析儀以外標法測定試樣的氨基酸含量.計算公式:被檢出的某種氨基酸的含量/%=\\(A樣×M×c×f\\)/A標× 100式中:A樣為樣品中該氨基酸的峰面積;M 為該氨基酸分子量;c 為相應氨基酸標準液的濃度;f 為系數;A標為該氨基酸標準物的峰面積.

1.3.3.3 多酚組分分析

1\\)石榴籽樣品的處理取 1 mL 石榴籽多酚提取液于離心管中,15 000 r/min 離心 15 min,過 0.22 μm 的濾膜.

2\\)多酚標準溶液的配制用色譜純的甲醇分別配制 1 mg/mL 的沒食子酸、安石榴甙、綠原酸、咖啡酸、兒茶素、表兒茶素、阿魏酸、山奈酚標準溶液,0.2 mg/mL 的原花色素標準溶液,0.5 mg/mL 的鞣酸標準溶液.并將上述單標溶液配制成3 個濃度梯度的混合標準溶液.標準品溶液不使用時放于 4 ℃冰箱中保存.

3\\)多酚的測定方法[16]色譜柱為 C18反相色譜柱\\(250 mm × 21.1 mm,5 μm\\),柱溫 30 ℃,檢測器為 SPD-M20A 二極管陣列檢測器,波長范圍為 200 nm~800 nm,流動相為 3 %的乙酸溶液\\(A 液\\)和甲醇溶液\\(B 液\\),線性梯度洗脫,流速為 1 mL/min.梯度洗脫程序:15 %~25 % B 液\\(15 min\\),25%B 液\\(10min\\),25%~75%B液\\(40min\\),75 %~15 % B 液\\(5 min\\),15 %B 液\\(5 min\\),進樣量20 μL,檢測波長:280 nm.

2 結果與分析

2.1 3 種石榴籽的脂肪、蛋白質和多酚的含量

3 種石榴籽中主要成分的含量見表 1.表 1 列出了 3 種石榴籽的脂肪、蛋白質和多酚的含量,可以看出脂肪和蛋白質在石榴籽中含量較豐富,總酚、總黃酮、總單寧和原花色素的含量較小,但是,隨著品種的不同,這些物質的含量都具有極顯著的差異性."凈皮甜"和"酸石榴"2 種紅色石榴的脂肪和蛋白質含量均高于"三白甜"這一白石榴的,總酚含量是"酸石榴"的高于"三白甜"和"凈皮甜"的.

2.2 3 種石榴籽的脂肪酸、氨基酸和多酚組分分析

2.2.1 3 種石榴籽油的脂肪酸組成通過 GC-MS 分析,3 種石榴籽油均主要含有 10種脂肪酸成分,且石榴酸含量最高.苗利利[15]等認為提取方法對石榴籽油中石榴酸含量影響較大,超聲波輔助提取和微波輔助提取比索氏抽提所得石榴籽油的石榴酸含量要高,趙淑娟[13]等認為甲酯化方法對石榴酸和其他脂肪酸含量也有較大影響,堿法甲酯化優于酸法甲酯化.本試驗結果表明,石榴品種也對石榴籽油中石榴酸及其他脂肪酸含量有影響,3 種石榴籽油的石榴酸相對含量的排序為:"三白甜"\\(77.51 %\\)>"凈皮甜"\\(74.58 %\\)>"酸石榴"\\(68.98 %\\),但 3 個供試栽培品種籽油的不飽和脂肪酸含量均高達 90 %以上.

2.2.2 3 種石榴籽蛋白質中氨基酸的組成分析3 個品種石榴籽蛋白質中氨基酸的組成見表 3.由表 3 可知,3 種石榴籽蛋白質中含有 16 種常見氨基酸,其中色氨酸可能是由于其易水解而沒有檢測到,除了蛋氨酸和色氨酸之外的其他 6 種必需氨基酸都可以檢測到,這與 Walid Elfalleh[17]等的報道略有不同.3 種石榴籽蛋白質中氨基酸的種類都相同,且氨基酸組成較全面,但是",凈皮甜"和"酸石榴"籽蛋白質中氨基酸的含量明顯高于"三白甜"的,必需氨基酸的含量也高于"三白甜"的,而"酸石榴"中各氨基酸的含量又略高于"凈皮甜"的.

2.2.3 3 種石榴籽中酚類物質組分與含量差異3 種石榴籽中酚類物質含量比較見表 4.由表 4 可知,各品種石榴籽中所含的酚類物質含量存在較大的差異,檢出的酚類物質中,兒茶素、安石榴甙和咖啡酸的含量較高,在"三白甜"中合計占91.28 mg/100 g 籽,高于"凈皮甜"\\(83.81 mg/100 g 籽\\)和"酸石榴"\\(90.04mg/100 g 籽\\).沒食子酸、綠原酸、表兒茶素、花青素、阿魏酸、鞣花酸、山奈酚等物質在 3 種石榴籽中均被檢出,但是,其含量都很少,酚類物質總量"酸石榴"最高.

3 結論

1\\)隨著品種的不同,石榴籽中脂肪、蛋白質和多酚在組成含量上具有較大的差異性.其中,粗脂肪含量以"酸石榴"\\(26.410±0.100\\)g/100 g 籽為最高,蛋白質含量以"凈皮甜"石榴\\(26.360±0.861\\)g/100 g 籽最高,總酚、總黃酮.總單寧、原花色素含量都很小,均以"酸石榴"的為最高.

2\\)3 個品種石榴籽油中不飽和脂肪酸含量都高達90 %以上,主要組分石榴酸的相對含量以"三白甜"石榴\\(77.51 %\\)為最高,依次大于"凈皮甜"石榴\\(74.58 %\\)和"酸石榴"\\(68.98 %\\).

3\\)3 個栽培品種石榴籽蛋白質中氨基酸組成均較完全,有 6 種必需氨基酸\\(賴氨酸、苯基丙氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸\\)被檢出,其中"酸石榴"中氨基酸總量\\(17.49 %\\)最多,必需氨基酸的相對含量\\(4.24 %\\)也比"凈皮甜"\\(4.07%\\)和"三白甜"\\(3.26%\\)高.

4\\)各石榴籽中酚類物質含量都很小,但是在這些酚類物質中,安石榴甙、兒茶素和咖啡酸這 3 類物質的含量相對都很高.

綜上所述,石榴籽中各物質的組分含量與品種有很大的關系,"凈皮甜"石榴和"酸石榴"的各種成分均比"三白甜"石榴要高.本研究可為進一步認識和開發石榴籽以及石榴品種的選育提供理論支持.