MicroRNA（miRNA）是一類長約為 22 個核苷酸（ nt）的內源性非編碼小分子單鏈 RNA,普遍存在于真核細胞中[1]. miRNA 由長約 70 nt 具有莖環結構的 microRNA 前體經核酸酶 Dicer 剪切產生[2]. 在細胞增殖、分化和腫瘤發生時，通過 RNA 誘導沉默復合物（RISC）的協調作用[3,4]1,從而調控靶基因的表達。自Lee 等[6]在 1993 年首次從線蟲中發現了真正意義上的miRNA-lin-4 以來，研究者已經確定了人類基因組中超過 450 種的 microRNA. miRNA 可以控制超過 50%人類編碼基因的活性，在生物發育、細胞分化、凋亡、增殖和免疫等生物過程中發揮著至關重要的調控作用[7~10]. miRNA 在人體組織和血液中的異常表達與癌癥的發生、發展和治療反應密切相關[11~15]. miRNA 可作為癌癥診斷和預測的生物標記物，也可作為新藥物的潛在作用靶點[16,17]. 因此，miRNA 的超靈敏檢測有助于臨床早期診斷與抗癌藥物的研發。然而，由于 miRNA 片段小、在細胞中表達量低和序列同源性高，致使 miRNA 的超靈敏檢測面臨許多挑戰[18].

傳統的 miRNA 分析方法包括 Northern 印跡雜交法[19~21]、微陣列分析法[22~25]和實時定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）[5,16,26,27]等，這些方法準確度高、應用廣泛，但也存在一些不足。Northern 印跡雜交法耗時費力、靈敏度低、樣品需求量大，且不能用于低豐度miRNA 的測定。 微陣列分析方法可用于發現新的 miRNA[28],并且可實現 miRNA 的多重檢測，但其靈敏度較低[22]、特異性較差、動態范圍較窄、芯片制作和檢測費用高[29]且重復性差。qRT-PCR 操作簡單、靈敏度高[30,31],但 miRNA 序列較短限制了其逆轉錄環節[32],且 qRT-PCR 通常需要復雜的引物設計和精確的溫度控制[33]. 另外，PCR 過程中非特異性擴增也容易導致假陽性[34].

近年來，發展了許多新的 miRNA 分析方法，顯著提高了檢測靈敏度。這些方法引入了生物發光[35~37]、酶分析[38~40]、分子信標[41]、深度測序[42]以及基于鎖核酸[43,44]和橋連鏈式反應[45],但依然存在一些無法避免的缺陷。生物發光法[35,36]使用生物發光蛋白 Renilla 熒光素酶作為標記物，操作簡單，但其分析原理基于發光信號的減弱。酶分析法[39]具有信號放大效果好的優點，但特異性和靈敏度相對較低。深度測序[42]可用于快速定量分析 miRNA 的絕對水平，但是檢測成本較高?；阪i核酸和橋連鏈式反應的分析方法需要固定 /分離步驟[43]和設計復雜的 DNA 探針[45],限制了其應用。

由于 miRNA 長度短且豐度低，需要引入信號放大來提高miRNA 檢測的靈敏度。 研究者先后將雜交鏈式反應（Hybridization chain reaction,HCR）、滾環擴增（Rolling circle amplification,RCA）及鏈置換擴增（ Strand displacement amplification,SDA）等擴增反應與比色分析[46~49]、熒光[41,50~52]、化學發光[53~56]、表面增強拉曼[57~60]、單分子檢測[61~63]和電化學分析[64~66]結合起來，實現了 miRNA 的超靈敏檢測。本文結合本課題組的工作對近年來 miRNA 檢測方法的進展進行了較為全面的評述。

1 miRNA檢測方法

1.1比色法

比色法可依據顏色變化對 miRNA 進行定量分析，具有操作簡單、結果直觀、成本低以及靈敏度高等優點[67]. 近來，具有催化活性的 DNA 酶和納米金顆粒的引入使比色法展示了更大的發展空間[68].納米金顆粒在分散狀態下顯紅色，團聚后顯藍色，可用于 miRNA 的快速檢測[69]. Zou 等[46]將催化發夾組裝（CHA）與 HCR 相結合，實現了 let-7a miRNA 的免標記、無酶分析。他們設計了 4種發夾探針，分別是 H1,H2,H3 和H4. 當沒有目標 miRNA 時，4個探針在溶液中保持穩定的發夾結構，不產生放大信號。當存在目標 miRNA 時，目標 miRNA 首先結合并打開探針 H1;接著，探針 H2 與H1 雜交形成H1-H2 雙鏈，并釋放 miRNA,啟動下一個循環，引發 CHA 反應。同時，CHA 反應形成的 H1-H2 雙鏈可與探針 H3 雜交，啟動 HCR 反應，打開探針 H3 和H4,產生大量 G-四聯體結構。G-四聯體結構在輔因1NA 酶，可催化 H2O2將無色 ABTS2-離子氧化成綠色ABTS-離子，產生顏色變化。該方法無需使用蛋白酶和化學修飾，成本低，可在等溫均質條件下進行，避免了復雜的分離程序和耗時的熱循環。通過 CHA 和HCR 雙重信號放大，檢出限可達 7. 4 fmol/L,檢測范圍跨越 6個數量級（10-14~ 10-8mol / L），并可區分靶序列中單個堿基的差異，在疾病診斷中具有潛在應用價值。另外，Jiang 等[47]將等溫擴增技術 SDA 和DNA 酶相結合，應用 ABTS 比色定量檢測miRNA,檢出限低至 0. 5 fmol / L.

納米金比色法也廣泛應用于 miRNA 分析。Gao 等[48]利用納米金顆粒和雙鏈特異性核酸酶（DSN），實現了 miRNA 的實時、免標記分析。在無目標 miRNA 存在時，納米金通過 DNA 探針交聯成網狀，呈現紅色。在目標 miRNA 存在時，DNA 探針可識別并結合目標 miRNA,形成雙鏈； 此雙鏈中的 DNA 序列隨后被 DSN 特異性識別并切割，釋放 miRNA 和納米金顆粒，使溶液呈現紫色。釋放的目標 miRNA可以繼續和核酸探針雜交，在 DSN 作用下引發等溫擴增循環，放大檢測信號。該方法無需標記，可在恒定溫度下擴增，檢出限低至 10-16mol / L. Ye 等[49]也報道了將納米金顆粒和 DSN 相結合用于序列特異性 miRNA 的比色分析。該方法具有無需分離和選擇性好的優點，檢出限為 16 pmol/L.

1.2熒光檢測

目前報道的熒光檢測法主要使用 SYBR Green Ⅰ，SYBR Green Ⅱ等熒光染料或 2-氨基嘌呤等熒光探針，對目標 miRNA 經核酸擴增后產生的產物進行定量分析[70,71]. Zhang 等[41]開發了基于發夾探針的循環指數擴增方法，用于超靈敏檢測 miRNA（圖 1）。靶miRNA 可在 Vent（exo-）DNA 聚合酶和 dNTPs存在下，延伸 DNA 模板，隨后在切口酶 Nt.Bst NBI 的作用下啟動第一個 SDA 反應，產生大量通用的觸發鏈。通用的觸發鏈可與同時帶有熒光基團和猝滅基團的發夾型探針 3‘末端進行雜交，通過延伸反應打開發夾型探針，導致熒光基團和猝滅基團分離，產生熒光信號。另外，通用的觸發鏈可作為引物引發第二個 SDA 反應，產生可以作為第一個 SDA 反應引物的新觸發鏈，使 2個SDA 反應得以循環往復，形成循環指數擴增，產生放大熒光信號。該方法利用延伸反應（而不是常用的由熱力學平衡控制的雜交反應）打開發夾探針，極大地簡化了實驗設計。由于引入循環指數擴增，此法檢出限低至 0. 38 pmol/L,并可應用于實際樣品中 miRNA 的定量分析。

Zhang 等[50]還開發了一種雙功能 SDA 介導的超分支滾環擴增（ HRCA）方法，用于超靈敏檢測let-7a miRNA. 實驗原理如圖 2所示： 靶 miRNA 與線性模板雜交后引發延伸反應，隨后在切口酶Nb.Bsm I的輔助下引發雙功能 SDA 反應，產生的大量 DNA 片段可作為第一和第二引物引發 HRCA 反應。HRCA 產物可利用熒光指示劑 SYBR Green Ⅰ進行檢測。此方法利用雙功能 SDA 反應同時產生了2 種可作為HRCA 反應引物的觸發物，實驗過程中無需特別設計其它引物，檢出限低至 0. 18 pmol / L,且選擇性好，可直接用于分析人體肺組織中總 RNA,在臨床疾病診斷中具有潛在應用價值。

值得注意的是，Zhang 等[51]利用發夾型探針介導的滾環擴增（HP-RCA）實現了對肺癌血清中循環miRNA 的超靈敏檢測。在該方法中，靶 miRNA 可與發夾型探針雜交，打開發夾，裸露出能與環形模板結合的部分，可在 phi29 DNA 聚合酶作用下引發 RCA 反應。RCA 反應產生的單鏈 DNA 產物可用 SYBRGreen Ⅱ染料進行定量分析。該方法實驗操作簡單，無需 miRNA 純化過程，能夠準確區分非小細胞肺癌（NSCLC）患者和健康人中血清 miR-486-5p 的不同表達水平，檢出限達 10-14mol / L,可應用于肺癌的早期診斷。

Zhang 等[52]還利用 2-氨基嘌呤探針建立了免猝滅熒光法，用于檢測人體肺組織中 let-7a miRNA.腺嘌呤代替物 2-氨基嘌呤能發出熒光，但其熒光信號會被相鄰堆積的堿基猝滅。如圖 3所示，靶miRNA可作為引物與 2-氨基嘌呤探針結合，在 KF 聚合酶作用下引發延伸反應，產生雙鏈 DNA,并釋放輔助 DNA. 雙鏈 DNA 中含有 2-氨基嘌呤的鏈被 Nb.Bts I 切口酶和 λ核酸外切酶切割，釋放出游離2-氨基嘌呤分子，產生熒光信號。若不存在靶 miRNA,KF 酶無法發揮作用，切口酶無法完成切割，因而不會產生熒光信號。該方法不需引入新的猝滅劑，輔助 DNA 的引入顯著增強了檢測信噪比，檢出限低至 0. 3 fmol/L,可直接用于肺癌組織中的 miRNA 分析。

1.3化學發光檢測

化學發光分析利用化學發光物質由激發態躍遷回基態時發出的光信號進行定量分析[72]. 因為無需外加光源，化學發光分析具有靈敏度高、操作方便及易于實現自動化等優點[73],在生化分析領域應用廣泛[74]. 化學發光分析與擴增技術聯用可以實現 miRNA 的超靈敏檢測。Ye 等[53]將基于聚多巴胺（PDA）納米球的化學發光共振能量轉移（CRET）和基于 DSN 的信號擴增相結合，用于 miRNA 的定量分析。他們設計的探針含有 2個區域： 區域Ⅰ是靶 miRNA 的互補序列，探針通過此區域與 PDA 結合；區域Ⅱ是信號序列，可與氯高鐵血紅素組裝成具有酶活性的 DNA 酶。 在靶 miRNA 存在時，探針區域Ⅰ與 miRNA 雜交形成部分雙鏈結構，在 DSN 作用下探針區域Ⅰ被循環降解，從 PDA 納米球中釋放出大量 DNA 酶，催化魯米諾和過氧化氫反應產生化學發光信號。在無靶 miRNA 存在時，DSN 無法進行切割，DNA 酶產生的化學發光信號經 CRET 反應被 PDA 猝滅。因此，化學發光信號的強弱可用于指示靶miRNA 的豐度。該方法無需添加有機染料或標記物，能辨別單堿基差異，具有易操作和低成本的優點，可用于檢測生物樣品中 miR-122,檢出限達 49. 6 pmol/L.

Yeung 等[54]將 poly（U）聚合酶催化的 miRNA 聚合作用與化學發光顯微成像相結合，用于超靈敏檢測 miR-20. 首先將與靶 miRNA 互補的鎖核酸（LNA）探針固定在蓋玻片上。miRNA 和鎖核酸互補雜交，在 poly（U）聚合酶和 UTP 存在下延伸，產生大量焦磷酸酯（PPi）。 PPi 與ATP 酶、硫酸銨、熒光素和熒光素酶混合，產生化學發光信號?；瘜W發光信號的強度可用于指示靶 miRNA 的濃度。此方法的檢出限為 50 fmol/L,如增加曝光時間可進一步提高檢測靈敏度。利用不同的捕獲探針，并結合生物傳感器陣列，可實現 miRNA 的多重檢測。