中藥化學成分是中藥藥效的物質基礎，但往往一味中藥就囊括了從極性到非極性、從小分子到大分子的多種化合物，其組成極為復雜。因此，對中藥化學成分進行全面、快速地表征一直是中藥分析研究的熱點與難點，也是研究和闡明中藥藥效物質基礎的先決條件。在現代中藥研究中，色譜技術尤其是液相色譜（LC）作為最常用的分離、分析手段扮演著不可替代的角色。多維液相色譜的建立和運用也為中藥物質基礎表征和活性成分篩選提供了新技術。本文對在線二維（2D）液相色譜技術在中藥研究中的應用進行了綜述，以期為中藥現代化研究提供新的思路。

1二維液相色譜的發展及類型

近20年，色譜柱的固定相類型、填料粒徑和高壓系統的發展大大提高了色譜分析的速度，色譜的分離模式也逐漸由一維模式向多維模式發展[1].根據多維色譜聯用的總峰容量約等于各維峰容量的乘積這一理論[2],將兩種以上不同分離機理的色譜柱串聯使用，可顯著提高分析的分辨率和峰容量，適于中藥復雜成分的分析和表征[3].

最初建立的二維液相色譜為離線（off-line）模式，即將第一維（1D）色譜洗脫的餾分收集、濃縮后，再進行第二維（2D）色譜分析[4].這種方法的兩個色譜柱往往不直接關聯，不受流動相兼容問題的影響，因而可以采用不同分離機理的兩種色譜進行分析，且儀器裝置比較簡單[5].然而離線模式在收集-濃縮-再分析的過程中樣品易損失、重現性差，且耗時、耗力[6],因此從離線模式發展為在線（on-line）模式是當今二維液相色譜的發展趨勢。在線二維模式是通過閥或相應部件將兩根色譜柱相連，1D色譜洗脫的餾分自動進入2D液相色譜[7].在線模式可分為中心切割二維液相色譜（heart-cutting LC-LC）和全二維液相色譜（comprehensive LC×LC）兩種。

1.1中心切割二維液相色譜

Heart-cutting LC-LC模式是指混合物經第一維色譜分離后，目標物的一個或幾個組分通過在線切換依次轉入第二維色譜，從而進一步分離分析。通常目標組分會按照出峰時間整個切入第二維，因此需要在第一維色譜后連接檢測器進行監測。兩維色譜之間常以六通閥進行連接，若第一維和第二維需采用不同的流動相，還會再增加一個定量環（loop環）或富集柱進行目標組分的收集或富集，其典型裝置示意圖見圖1.六通閥首先在A位置，樣品在第一維色譜柱上進行分析；當目標組分出峰并在loop環中完成收集后，六通閥切換到B位置，目標組分進入第二維色譜進行分離；此時第一維色譜可根據下一個目標組分的出峰時間繼續分析或停止等待。該模式中第一維色譜和第二維色譜不（不必須）同時進行工作，完成一次分析所需時間為第一維色譜分析時間與第二維色譜分析時間之和，但與off-line模式相比，提高了自動化程度。在線模式方法的建立及條件優化主要考慮第一維色譜的切出/第二維色譜的切入時間，以及一維色譜餾分的體積對二維色譜峰展寬的影響。為使第一維切出的組分獲得更好的分離，第二維通常選用更長的色譜柱及更多變的分析梯度。

1.2全二維液相色譜

全二維液相色譜模式是樣品經第一維色譜分離后所有組分均通過閥切換轉入第二維色譜進行分析的在線二維液相色譜模式。根據Schoenmakers等[8]提出的定義，全二維色譜需包含以下3個特征：（1）樣品中所有成分的分離分析均經過兩種模式；（2）所有樣品成分均以同等比例經過兩維分離柱后進入檢測器；（3）樣品中任意兩個化合物在第一維色譜柱中的分離順序和分離度會傳遞至第二維色譜柱。在所建立的全二維液相色譜系統中，第二維可采用兩根平行的色譜柱進行交替分析[9],或通過在第一維色譜和第二維色譜間連接的兩個loop環交替收集后，再分別進入第二維色譜。目前以loop環模式最為常用，通過二位八通閥、二位十通閥或雙二位四通閥實現在線切換（見圖2）。在進行分析時，切換閥首先在A位置，第一維色譜柱的洗脫液進入loop環1,收集相應時間后，切換閥轉換到B位置，此時loop環1收集的組分進入第二維色譜柱進行分析，第一維色譜柱的洗脫液進入loop環2進行收集；相應時間后，切換閥切回到A位置，進行下一輪的收集和分析；如此往復進行，直至第一維色譜的洗脫液全部進入第二維色譜完成分析。二位八通閥和二位十通閥是全二維液相色譜較常用的切換閥，二位八通閥的連接流路比較簡單，但其中一個loop環的收集和洗脫會出現不同方向的情況（見圖2a）；二位十通閥可以保證兩個loop環收集和洗脫均同方向，但收集和洗脫的流路長短不一致（見圖2b）。上述兩種模式均因流路不對稱對全二維液相色譜方法的建立和優化有較高要求。近期發展的雙二位四通閥設計則可以實現流路的完全對稱（見圖2c），進一步簡化了全二維液相色譜方法的建立和運用。

全二維液相色譜的自動化程度更高，色譜峰數據也不再是典型的保留時間-響應高度的二維圖，而是通過數據處理重新擬合生成的三維等高線圖，即第一維色譜流出液到第二維色譜的切換不依賴于第一維色譜的出峰情況，而是將等時間的餾分交替切入第二維色譜中，因此全二維液相色譜的發展和建立依賴于儀器控制和數據處理軟件的構建[10].此外，第二維色譜需交替分析第一維色譜洗脫的餾分，其分析一次的時間等于loop環收集一次樣品的時間，分析次數等于兩個loop環收集樣品的總次數，因此整個全二維液相色譜一次分析的時長取決于第一維色譜的分析時間。在方法建立和條件優化時，需著重考慮第一維色譜流速和閥切換時間與loop環收集體積的匹配；loop環收集體積對第二維色譜峰展寬的影響；第二維色譜峰的分析效率；第一維和第二維色譜間流動相的兼容性。

在色譜柱選擇方面，全二維液相色譜的第一維通常采用微徑色譜柱（micro-bore column）以低流速（μL/ min）進行洗脫，以減小loop環的收集體積，避免第二維色譜的色譜峰展寬；早期的第二維色譜常采用柱體積較大的色譜柱以降低高流速引起的高背壓，且采用等度洗脫以減少色譜平衡時間。隨著高壓/超高壓液相色譜的出現和發展，目前第二維色譜多采用超高壓色譜柱以大流速快速完成分析。

2二維液相色譜在中藥分析中的應用

2.1中藥物質基礎表征

全二維液相色譜自1978年由Erni等[11]建立以來，在多肽等混合物樣品分析中得到了廣泛應用。鄒漢法研究員課題組首先于2004年將構建的全二維液相色譜系統用于中藥川芎的多成分分析[12].第一維采用氰基 （CN）柱 （200 mm × 2. 0 mm,5μm），以甲醇-水系統為流動相，在0. 04 mL / min的流速下梯度洗脫215 min,loop環的體積為200μL,收集5 min;第二維采用ODS柱（200 mm×2. 0mm,5 μm），以乙腈-0. 1%（v / v）乙酸水系統為流動相，在0. 7 mL/ min的流速下等度洗脫，完成一次分析需5 min,共分析43次，分析過程中隨著第一維色譜柱洗脫梯度的變化改變第二維色譜的起始梯度，但在一次分析中仍保持等度洗脫。該反相×反相（RP×RP）的全二維色譜系統可較好地兼顧中藥化學成分中大極性和小極性的化合物。應用該方法并結合質譜檢測器，從川芎提取物中檢測到了52種化合物。該課題組根據范氏方程進一步優化了第一維CN柱的流速（0. 13 mL/ min），并將第二維色譜柱更換為更耐壓的ODS整體柱，以3. 0 mL/ min的流速洗脫，完成一次分析需1. 5 min,提高了色譜的分辨率，并通過改進色譜峰處理軟件算法來區分相對豐度較低的峰，使改進的全二維LC×LC法的峰容量提高到2 440 peak/ 130 min,并從川芎的提取物中檢測到120種化合物[13].在此基礎上，鄒漢法研究員課題組先后建立了脂質體柱-ODS柱系統用于銀杏提取物、龍膽瀉肝湯等中藥成分的分析[14,15],為全二維液相色譜用于中藥復雜成分的分析奠定了基礎。

本文對近10年報道的用于中藥分析的全二維液相色譜法進行了總結（見表1）?？梢钥闯?，隨著色譜柱填料類型的多樣化、商品化，以及高壓/超高壓液相色譜系統的出現和數據處理軟件的完善和普及，建立的全二維液相色譜方法更加簡便，且應用范圍更廣。例如銀杏葉提取物中的黃酮類成分較多，且幾乎都是以山柰酚、槲皮素和異鼠李素作為苷原的結構類似物，采用一維色譜分析較困難，而采用二維色譜分析時，從銀杏葉提取物中檢測出了61種黃酮類化合物，其中25種化合物具有較好的活性[26],與一維色譜方法相比，分析能力大大提高。值得注意的是，由于流動相兼容性和大多數天然產物分離機制的限制，用于中藥多成分分析的全二維液相色譜多為RP×RP模式。Tian等[19]和Wei等[20]構建了用于中藥分析的正相×反相（NP×RP）全二維液相色譜模式，雖然通過控制流動相溫度或改進接口可以克服流動相兼容問題，但在分析過程中，第一維色譜需暫停分析，等第二維分析結束后再繼續進行，即第一維和第二維之間難以實現快速切換，分析時間較長。