0 引 言
近 20 年來，開發的新藥當中有 64%的小分子藥物來源于天然產物或天然產物的衍生物。這些天然產物結構多樣，具有獨特的生物活性，是微生物的次級代謝產物。天然產物結構復雜多樣，導致獲取有藥物活性的類似物難度變大。組合生物合成利用底物寬泛性和酶工程制備新的非天然產物，使具有潛在活性的天然產物種類多樣化。組合生物合成應用于藥物開發，有 3 個優點： （1） 組合生物合成有助于提高天然產物結構框架新穎性和多樣性，增加了天然產物的生物特征； （2） 組合生物學是一種制備天然產物類似物的環境友好型方式； （3）在基因改良的異源宿主細胞中高效表達組合生物合成途徑能夠增加化合物產量，降低藥物成本。組合生物合成方法有如下 3 種： （1） 前體 - 定向生物合成； （2） 酶 - 水平修飾，整個結構域、模塊和亞基的置換，定點突變，定向進化； （3） 途徑 -水平的重組。
1 前體 - 定向組合生物合成
天然產物組裝鏈中構建模塊的多樣性決定了天然產物結構多樣性。前體 - 定向組合生物合成利用酶的底物寬泛性，在合成途徑中摻入非天然結構單元，產生多種天然產物類似物。
模塊化 I 型聚酮合酶 （mPKSs） 是含有序列化模塊的聚酮合酶 （PKS） 組裝鏈，它的每個模塊都有一系列催化鏈式循環反應的催化域。聚醚類抗菌素 Monensin 是 Streptomyces cinnamonensis 的mPKS 生物合成產物。Monensin PKS 的第 5 個模塊中乙酰轉移酶 （AT） 結構域能夠以非天然的丙二酸衍生物為結構單元合成新的 Monensin 前體類似物。Bravo- Rodriguez 等以 AT 域的計算模式為基礎，預測 AT結構域的活性位點能夠接受具有多個炔丙基基團的結構單元。在添加有炔丙基 - 丙二酰- N- 乙酰 - 巰乙胺的培養基中，S. CinnamonensisA495 能產生炔丙基 - premonensin.該化合物可以結合到人的磷酸二酯酶 δ 亞基 （PDEδ），能夠潛在地抑制 PDEδ- KRAS 相互作用，從而抑制KRAS- 依賴型人胰腺癌細胞的生長。
與 mPKSs 相似，非核糖體肽合成酶可以組裝多種藥用肽，包括抗生素 （放線菌素、達托霉素），免疫抑制劑 （環抱霉素 A） 和抗腫瘤藥物 （博來霉素）。尿苷肽抗生素 （比如 Pacidamycins 和Sansanmycins） 對高抗藥性病原體都有良好的抗菌活性，是具有底物寬泛性的 NRPSs 的組裝產物。
Grüschow 等發現 Pacidamycin 的生物合成途徑對大部分 Tryptophan 類似物具有底物寬泛性，從而可以獲得新的 Pacidamycin 衍生物。
2 酶水平組合生物合成
2.1 整個結構域及模塊和亞基的交換
交換整個結構域、模塊和亞基是組合生物合成的經典方法。模塊化 PKSs 和 NRPSs 具有模塊化組織和逐步合成策略的特點，適用于組合生物合成。用來自雷帕霉素 mPKS 的 AT 結構域和 β- C 過程結構域替換紅霉素 mPKS 的各自對應的結構域，可以構建 61 種 6- 脫氧紅霉素 B（6- DEB） 類似物組合庫。
NRPSs 模塊化途徑中 GTs 大部分屬于 GT- B 結構超級家族，包括 2 個通過接頭環連接的功能域。通過交換接頭兩端的結構域可以得到 GT- B 型功能性嵌合酶。Parket 等利用卡那霉素 GT （kanE） N- 末端卡和萬古霉素 GT（GtfE） 的 C- 末端之間的不同交叉點，構建了 1 個嵌合酶庫。交換功能性結構域的 GT（HMT31） 能夠催化合成 2- DOS 衍生物。通過交換替考拉寧和 Chloroeremomycin 的 GTs 的N- 末端和 C- 末端，能夠獲得 2 種嵌合糖基轉移酶 GtfBH1 和 GtfBH2.嵌合酶可以改變底物特異性，從而獲得雜交糖肽類抗生素。
2.2 定點誘變和定向進化
傳統的結構域交換常導致蛋白不溶性表達，活性受到破壞，產量降低?，F代蛋白質工程，比如定點突變替換特定的氨基酸，可以更高效地改變酶的功能。ChristopherD.Reeves等將 6- DeoxyerythronolideB合成酶 （DEBS） 模塊 4 中乙酰轉移酶 （AT） 結構域的 3 個不同的負責特異性的主要區域，突變成丙二酰 - CoA- 特異結構域中的序列。發現單個區域突變或者 3 個區域全部突變可以得到功能性DEBSs,該 DEBSs 能夠產生天然聚酮類混合物 （6- Deoxyerythronolide B,新的類似物和 6- Desmethyl-6- deoxyerythronolide B）。這表明識別序列決定 AT的特異性，DEBS 能夠在模塊 4 中摻入丙二酸單元得到新的聚酮鏈。定向進化可以應用于定向改善酶的特性及闡述催化機制。
3 途徑水平組合生物合成
隨著分子合成生物技術的發展，實現了在特征宿主微生物中異源表達來自于不同屬的基因。從1985 年開始，雜交途徑廣泛應用于獲取新的天然產物，尤其是藥物研發領域。糖基在藥物靶向作用中起著重要作用，糖基化能夠顯著地影響藥物的溶解性和生物活性。大量的新型糖基化產物的產生，為藥物研發提供了機遇。糖基化聚酮類化合物 Mithramycin 能與 DNA 結合，抑制轉錄過程和蛋白合成。常用于治療多種癌癥，高鈣血癥和高鈣尿癥。但是它有致命的副作用，被限制用于臨床。
Nú觡ez 等在突變株 S. argillaceus M3W1 中表達含有糖基化 NDP- D- 洋地黃毒素糖合酶的質粒，獲得改變糖鏈或同時改變糖鏈和 3- 位側鏈的 7 種Mithramycin 類似物。得到的 Demycarosyl- 3D- β- D- digitoxosyl- mithramycin SK 比 Mithramycin 具有更高的抗腫瘤活性，毒性更低。
4 挑戰與前景
組合生物學利用合成途徑改組技術獲得了突變的天然產物結構類似物，使傳統合成領域發生了根本變化，在新藥開發過程中也發揮著重要作用。采用酶工程，合適的表達宿主和代謝工程可以解決產量低的“瓶頸”.
另外，藥物開發需要龐大的化合物庫，新的快速 DNA 合成和組裝技術可以解決傳統克隆對工程化生物催化和組合生物學產物的通量的限制。因此，急需高通量篩選方法篩選大量候選化合物。用計算機方法結合結構 - 生物活性分析進行優化設計，以確保獲得所需的活性。
結構域或模塊交換方法面臨的挑戰是嵌合合成的產物不溶性表達或者功能受損。由于目前對蛋白折疊動力學的理解不完整，并且能量平臺模式也存在問題，因此需要計算機工具來精確預測蛋白構型以及結構域 - 結構域和模塊 - 模塊之間的相互作用。另外，許多藥物生物活性的分子機制研究并不透徹，比如還不清楚糖基團與活性之間的關系。為了充分利用組合生物合成，必須更好地理解關鍵酶的動力學和機制以及代謝途徑。
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