很多蛋白質或多肽在一定條件下可以形成淀粉樣纖維，至少20 多種人類疾病如阿爾茨海默病、帕金森氏病、家族性淀粉樣神經病變以及Ⅱ型糖尿病等與此類淀粉樣纖維沉積有關[1~4]. 胰島素是一種由 51 個氨基酸殘基組成的多肽，極易形成淀粉樣纖維，通常將其作為研究多肽淀粉樣纖維化、篩選抗纖維化藥物以及纖維細胞毒性分子機制的模型分子[5]. 雖然目前尚無證據表明任何疾病與胰島素纖維化有關，但在臨床應用中，胰島素在生產、儲存過程中以及在注射部位形成的纖維可能對病人產生免疫原性[6].

為抑制蛋白質淀粉樣纖維化，溶解或者破壞淀粉樣纖維結構被認為是治療相關疾病的有效途徑。多酚化合物，特別是一些天然多酚類物質可以抑制蛋白質的纖維化[7~9],并能夠破壞成熟的纖維結構，將其轉變為無定形聚集體，降低纖維的細胞毒性作用[10]. 這些多酚的抗多肽纖維化作用被認為既與其多環和多羥基結構有關，也可能與其抗氧化作用或促氧化作用有關[11,12],但具體作用機制尚無定論。

本文采用牛胰島素作為模型分子，探索了幾種結構相近的簡單多酚化合物對多肽淀粉樣纖維化的抑制作用，以期從這些化合物的構效關系來揭示多酚類化合物抗多肽淀粉樣纖維化的分子機制。

1 試驗部分

1.1 試劑與儀器

牛胰島素（ 分子量 5733） 、硫黃素（ ThT） 、氯化硝基四氮唑藍（ Nitroblue NBT） 、酚化合物及對苯醌購自 Sigma-Aldrich 公司； 電泳相關試劑購自 Bio-Rad 公司； 其它試劑均為國產分析純。LS-55 型熒光分光光度計 （ 美國 Perkin-Elmer 公司） ; JEM-1400 型透射電子顯微鏡 （ 日本 JEOL公司） .

1.2 實驗過程

1.2.1 胰島素淀粉樣纖維的制備 用 20 mmol / L 鹽酸溶液（ pH = 1. 7） 配制 100 μmol / L 牛胰島素水溶液，加入不同濃度的酚化合物，于 50 ℃水浴中孵育 5 d,按一定的時間間隔取樣并在 4 ℃保存備用。

1.2.2 ThT 熒光檢測 用 10 mmol / L 磷酸鹽緩沖液（ pH = 7. 0） 配制 1 mmol / L ThT 溶液，于 4 ℃ 避光保存備用。 取 10 μL 孵育的胰島素樣品，加至 10 mmol/L Tris-HCl 溶液（ pH=8. 0） 中，再加入 30 μL ThT溶液使其終濃度為 10 μmol/L,振蕩 10 s 左右，用熒光分光光度計記錄熒光強度（ 激發波長為 440 nm,發射波長為 484 nm） .

1.2.3 透射電子顯微鏡（ TEM） 觀察聚集體形態 將制備的胰島素纖維或者聚集體用二次蒸餾水稀釋 5倍，取15 μL滴于鍍膜銅網上，靜置 10 min 后用濾紙沿邊緣吸干，滴加 15 μL 醋酸鈾（ 質量分數為 2%）染色 10 min. 用透射電子顯微鏡觀察纖維形態并拍照（ 電壓 80 kV） .

1.2.4 SDS-凝膠電泳及電轉分析 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDS-PAGE） 采用分離膠（ 質量分數為15%） 在 Tricine 緩沖體系（ pH = 8. 2） 中進行，胰島素加樣量為 10 μg,用考馬斯亮藍染色。 采用 GEHealthcare 電轉盒將凝膠上的條帶轉至聚偏氟乙烯（ PVDF） 膜上，在堿性（ pH = 10） 條件下由 NBT 染色。

2 結果與討論

實驗條件下，胰島素可在約 4~5 d 形成成熟的淀粉樣纖維，纖維的生長過程采用 ThT 熒光法監測。ThT 是一種能夠與淀粉樣纖維的 β 片層結構特異性結合的熒光探針，當與淀粉樣纖維結合時，其在440 nm 波長光激發下產生 484 nm 的特征熒光發射峰。 與大多數蛋白質纖維化過程相似，胰島素的纖維生長過程也具有成核-聚合的動力學特征[13],即纖維化主要包括成核、生長和成熟 3 個階段，ThT 熒光曲線表現為 S 型特征[見圖 1（ A） ].

由圖 1（ A） 可見，各種酚化合物對胰島素的淀粉樣纖維化作用不同。 200 μmol/L 的苯酚和間苯二酚對胰島素纖維化有一定的促進作用，相應的 ThT 熒光在 1. 5 d 后開始增強，表明其具有較短的成核期； 與之相比，相同濃度的鄰苯二酚和對苯二酚則對胰島素纖維化表現出明顯的抑制作用，相應的ThT 熒光在孵育 3 d 后開始略有上升，第 5 d 的熒光強度僅為胰島素對照樣品的 27%和 19%. 由于鄰苯二酚和對苯二酚的纖維化抑制作用可能與其氧化產物醌中間體相關，故采用對苯醌同時進行對照分析。 如圖 1（ A） 所示，在 200 μmol/L 對苯醌存在下，胰島素纖維化幾乎被完全抑制，整個孵育過程中ThT 熒光強度無明顯增加。

鄰苯二酚、對苯二酚和對苯醌對胰島素淀粉樣纖維化的抑制作用與濃度呈正相關。 對苯二酚的濃度效應如圖 1（ B） 所示，可見較低濃度的對苯二酚可延緩胰島素的纖維化，包括增加延遲期時間和降低纖維的生長速度。 鄰苯二酚和對苯醌的濃度效應與此相似，但對苯醌的抑制作用比 2 種苯酚強，100μmol/L 對苯醌即可完全抑制胰島素纖維的生長[圖 1（ C） ].

酚類化合物對胰島素淀粉樣纖維化的作用可進一步由 TEM 表征結果（ 圖 2） 證實。 作為對照的成熟胰島素纖維的直徑為 5~35 nm,長度分布為 600~3000 nm[圖 2（ A） ],能與剛果紅結合并在偏振光下顯現出特征的黃綠色，具有淀粉樣聚集體的特性。 當胰島素與 200 μmol/L 的苯酚[圖 2（ B） ]或間二苯酚[圖 2（ C） ]共孵育 5 d 后，纖維密度比對照樣品有所增加，與 ThT 熒光結果一致； 而相同濃度的鄰苯二酚[圖 2（ D） ]和對苯二酚[圖 2（ E） ]則明顯抑制纖維的生成，只能觀察到少量的細短纖維； 100μmol/L 對苯醌即可完全抑制纖維的生成，故僅能觀察到一些小的無定形聚集體[圖 2（ F） ].

研究表明，天然多酚化合物的抗多肽纖維化作用與其氧化還原性質有關[9,10],Hirohata 等[14]也報道天然多酚的氧化產物通常具有更強的抑制纖維化作用。 在本文選用的 4 種酚化合物中，鄰苯二酚和對苯二酚可抑制胰島素纖維化，而苯酚和間苯二酚則無此作用，這可能與前 2 種化合物具有更低的氧化還原電位，并且在氧化過程中易于形成醌類產物有關。 多酚經氧化后的醌類產物具有較高的反應活性，可修飾多肽鏈中的一些殘基，如氨基、巰基和一些雜環殘基等[15,16]. 電轉-NBT 染色實驗是一種特異性檢測醌修飾多肽的方法[17]. 凝膠電泳分離的多肽經電轉移至 PVDF 膜上，在堿性條件下，NBT 與醌修飾多肽反應轉變為藍色不溶物。 該反應具有較高的特異性和靈敏度，常用于生物樣品中醌修飾多肽的分析鑒定。

圖 3 示出了在酚化合物和苯醌存在下，孵育 5 d 的胰島素聚集體的 SDS 電泳[圖 3（ A） ]和相應的電轉-NBT 檢測結果[圖 3（ B） ]. 圖 3（ A） 泳道 1 和 2 分別是未經孵育的胰島素單體和孵育 5 d 的胰島素成熟纖維，可見在 SDS 的作用下，纖維被解聚為胰島素單體，不同的是，在泳道 2 胰島素單體上方可觀察到少量呈拖尾狀的聚集體； 苯酚（ 泳道 3） 和間苯二酚（ 泳道 5） 可促進這種 SDS 不溶聚集體的形成。

該多聚體的形成是否與淀粉樣纖維化有關，目前尚不清楚。 與之相比，加入鄰苯二酚（ 泳道 4） 、對苯二酚（ 泳道 6） 和苯醌（ 泳道 7） 的樣品除了少量二聚體外，在考馬斯亮藍染色條件下觀察不到拖尾狀的多聚體。

NBT 檢測結果表明，與鄰苯二酚、對苯二酚和苯醌共孵育 5 d 的胰島素可與 NBT 反應生成紫紅色產物，表明胰島素分子被醌所修飾； 而與苯酚和間苯二酚共孵育的胰島素則無此特征的紫紅色。 結合ThT 熒光和 TEM 結果可以推斷，鄰苯二酚和對苯二酚對胰島素纖維化的抑制作用與其轉變為醌中間體，進而與多肽鏈結合有關。 在 SDS 電泳和充分透析的條件下，醌仍然能夠與胰島素分子緊密結合，這種結合是否與共價作用有關，尚需進一步實驗證實。

為了進一步證實上述結論，在制備胰島素聚集體之前，在樣品中充分通入氮氣，以除去溶液中的氧，然后在密閉條件下，按照前述條件孵育 5 d. ThT 熒光結果[圖 4（ A） ]顯示，在無氧條件下，鄰苯二酚和對苯二酚對胰島素纖維化的抑制作用顯著降低，表現為最終孵育產物具有較強的 ThT 熒光； 而苯酚和間苯二酚與有氧條件下相同，對胰島素纖維化無抑制作用。 TEM 表征結果表明，在無氧條件下，與 200 μmol/L 鄰苯二酚[圖 4（ B） ]和對苯二酚[圖 4（ C） ]共孵育 5 d 的胰島素具有通常情況下的纖維形態和密度，即鄰苯二酚和對苯二酚在此條件下無抑制胰島素纖維化的作用，這與 ThT 熒光結果相符。

另外，對上述孵育 5 d 的樣品進行電轉-NBT 檢測發現，在無氧條件下加入所有酚化合物的樣品均不能被 NBT 染色（ 數據未給出） ,即未生成醌修飾胰島素。 上述結果充分說明，酚化合物經氧化形成醌中間體并對多肽鏈修飾是其抗多肽纖維化的主要途徑。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（ Epigallocatechin gallate,EGCG） 為綠茶的主要成分，是最有希望成為多肽纖維化相關疾病治療藥物的天然多酚化合物。 在抑制 β-淀粉樣肽及突觸核蛋白等纖維化過程的研究中，可觀察到 EGCG 形成醌中間體并對多肽修飾后的產物[18~20]. 但這種修飾在纖維化抑制過程中是否具有重要作用，仍然難以確定。 目前，對天然多酚的抗多肽纖維化的分子機制多采用完整的多酚分子與多肽鏈的作用模型[18]. 事實上，無論是在體實驗還是體外實驗，多酚化合物在介質中的穩定性十分有限，充分考慮其氧化產物醌中間體的作用是十分必要的。

3 結 論

研究了幾種具有單環結構的簡單酚化合物對胰島素纖維化的抑制作用，結果表明，能夠形成醌中間體的鄰苯二酚和對苯二酚具有抑制胰島素纖維化的作用，這種作用與對苯醌的作用相似； 而苯酚和間苯二酚在實驗條件下不能與胰島素形成醌修飾產物，也不具有抑制纖維化的作用。 在無氧條件下，鄰苯二酚和對苯二酚對胰島素纖維化的抑制作用明顯降低，說明酚化合物經氧化形成的醌中間體是其抗胰島素纖維化的主要活性結構。 這些醌中間體通過修飾多肽鏈改變了多肽鏈間的作用力，進而影響甚至阻斷胰島素分子自組裝為淀粉樣纖維。