1 背景介紹
蛋白質組學最早的工作來自于對細菌蛋白組的研究[1].1975 年，Patrick O'Farrell 使用二維聚丙烯酰胺凝膠電泳（2D-PAGE）對大腸桿菌（Escherichia coli）蛋白進行分離，得到超過 1000 個凝膠點，標志著人類第一次實現了對生物體全部蛋白進行系統層次的分離[2].隨著基因組學的發展和人類基因組計劃的進行，蛋白質組（proteome）這一概念最早于 1996 年被提出[3],指一個細胞或生物體內全部的蛋白質；分析蛋白質組的學科則被稱為蛋白質組學（proteomics）[4].蛋白質是生命活動的執行者，一切基因和轉錄層次的變化，最終都要在蛋白質的層次（如表達量和翻譯后修飾）發生變化才能表現出其生命意義。因此，蛋白質組學一直受到生命科學研究者的廣泛關注。
在基質輔助激光解吸（matrix assisted laser desorption ionization,MALDI）和電噴霧（electrospray ionization,ESI）這兩種可電離多肽和蛋白質的離子化技術產生后，基于質譜的蛋白質組學（ mass spectrome-try-based proteomics）得到了快速發展[5-6].多肽和蛋白質離子在一定的激發條件如碰撞誘導解離（colli-sion induced dissociation,CID）或電子俘獲解離（electron capture dissociation,ECD）等作用下，產生在肽鏈骨架上的斷裂，即可通過多肽/蛋白質的多級質譜得到其結構信息。與傳統分析化學和生物化學鑒定蛋白采用的氮端測序和免疫印跡等方法相比，基于質譜的蛋白質組學擁有分析速度快、樣品用量小、序列覆蓋率高、定量手段成熟、易于分析翻譯后修飾等眾多優點。因此，基于質譜的蛋白質組學成為當前蛋白質組學領域最主要也是發展最快的方法。
與高等真核生物的蛋白組相比，原核生物編碼的蛋白質數量少得多，蛋白的復雜性（如 RNA 剪切造成的一個基因對應多個蛋白）也遠遠小于高等真核生物。從分析化學的角度來說，體系的復雜度相對較小，因此以原核生物及其他微生物作為模型體系的蛋白質組學相對發展較快。在研究微生物的蛋白質組學時，一個具有重要科學意義的問題是病原微生物和與感染（infection）相關的蛋白質組學。世界衛生組織的統計數據表明，病原微生物引發的傳染病造成的死亡占 2011 年全部死亡原因的 1/3,因此對病原微生物感染過程的研究也具有極其重要和迫切的現實意義。在病原微生物入侵和感染宿主以及宿主拮抗病原微生物感染的過程中，執行關鍵生命活動的蛋白質究竟有哪些? 它們是如何發揮生命作用的? 這些問題都只有在蛋白質層次進行研究才能得到最終的解答。通過對這些重要生命過程分子機制的理解，人們將對病原微生物-宿主相互作用的過程有更加深入的認識，從而為設計抗感染的藥物以及抑制病原微生物引發的傳染病提供思路。
學術期刊 Proteomics 在 2011 年已出版了關于微生物蛋白質組學的?？痆7],其中大部分工作與病原微生物有關。本文將從病原微生物和宿主兩方面入手，簡要介紹應用蛋白質組學研究病原微生物感染過程的相關工作，著重介紹該領域最近幾年的主要進展，并對相關方面的發展做出展望。
2 病原微生物的蛋白質組學
2. 1 體外培養條件下病原微生物的蛋白質組學
在病原微生物-宿主相互作用體系中，病原微生物的蛋白組相對簡單，因此病原微生物成為應用蛋白質組學研究這個體系時的首要目標。體外培養條件下獲取大量病原微生物相對簡單，早期相關研究主要集中在體外培養環境下的病原微生物的蛋白質組學。
Adkins 等比較了野生型沙門氏菌（ Salmonella Typhimurium,LT2） 和一種毒性更強的沙門氏菌亞型（14028）在對數生長期、穩定期和缺鎂的基本培養基中的蛋白組[8],共鑒定到 2343 個蛋白。通過在系統層次比較兩種不同基因型的沙門氏菌的蛋白表達組，他們發現一些受pdu 啟動子調控的蛋白在14028 亞型中具有更高的表達量。他們的工作表明，pdu 啟動子對于沙門氏菌的致病性有著重要的意義。
Ansong 等比較了野生型、敲除 hfq 或 smpB 基因的沙門氏菌在 4 種體外培養條件下蛋白質組和轉錄組的差異[9].hfq 和 smpB 兩個突變株中 20%和 4%的蛋白表達發生了顯著變化，生物信息學分析表明受調控的蛋白包括與入侵相關、細胞基礎代謝、脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）合成、脂肪酸合成等功能。
Becher 等以穩定同位素（氮-15）代謝標記定量的方法鑒定了處于對數生長期和穩定期的金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）蛋白表達組[10].為了提高蛋白鑒定的覆蓋率，他們通過亞細胞分離的方法把金黃色葡萄球菌在體外條件下分成 4 個組分：胞漿蛋白、膜蛋白、細胞表面蛋白和胞外蛋白。最終他們鑒定到 1703 個蛋白（定量 1450 個蛋白），達到了對全蛋白組 65%的蛋白覆蓋率。
總結已有的工作，一些重要的病原微生物如沙門氏菌[8-9,11-13]、志賀氏菌[14-16]（Shigella flexneri） 、綠膿桿菌[17-19]（Pseudomonas aeruginosa） 、幽門螺桿菌[20-25]（Helicobacter pylori） 、結核分枝桿菌[26-27]（Myco-bacterium tuberculosis） 、金黃色葡萄球菌[10]、炭疽芽孢桿菌[28]（Bacillus anthracis） 在體外培養條件下的蛋白質組學都已有相關報道。與植物病原真菌相關的蛋白質組學工作也已有詳盡綜述發表[29],本文不再贅述。
感染宿主前后，病原微生物的生存環境有顯著的變化，因此病原微生物的應激反應是研究的一大重點。在體外培養中，病原微生物的代謝模式、生長速率控制以及刺激效應蛋白分泌（即模擬入侵宿主時的條件）下的蛋白調控一直是研究者關注的熱點。常見的控制條件為不同培養條件（無氧、高鹽、不同碳源、培養基中某些離子缺陷、溫度）、不同生長階段（對數期和平臺期）等。其中通過模擬感染后體內環境的體外培養條件研究感染時病原微生物發生的重要變化（如代謝調整（碳源和某些離子的代謝）、群體感應系統[30]（quorum sensing）等）通常是進一步生物研究的主要方向。通常的研究思路是通過蛋白質組學大規模表征病原微生物在不同培養條件下（或敲除某些關鍵基因后）的蛋白表達組變化，從而得出病原微生物的應激反應機理或其中關鍵蛋白的作用通路及信號網絡。也有一些工作研究了病原微生物中某些修飾組的變化，詳見 Jones[31]和 Macek[32]的綜述。
2. 2 感染過程中體內病原微生物的蛋白質組學
與大量宿主細胞相比，病原微生物的蛋白量通常遠小于宿主；同時，入侵宿主的病原微生物的量通常遠遠小于體外培養。因此，在體內蛋白組的實驗中，為了達到更高的選擇性和靈敏度，首先要解決的問題是從宿主細胞中分離出體內病原微生物。目前主要有 3 種分離方法[33],即離心（centrifugation）、基于免疫磁珠分離（immunomagnetic separation,IMS） 及流式細胞術（fluorescence-activated cell sorting,FACS）。
感染過程中體內微生物的蛋白質組學始于 2006 年 Becker 等的工作[34].他們采用流式細胞術從受到沙門氏菌感染的小鼠體內分離出沙門氏菌。在他們的分離條件下，對沙門氏菌蛋白的鑒定受到宿主蛋白的極大干擾，在鑒定到的蛋白中，超過 70% 都是宿主的蛋白。但液質聯用平臺極強的分離鑒定能力仍使他們共鑒定到約 700 個沙門氏菌的蛋白。進一步的生物信息學分析表明，沙門氏菌的代謝中廣泛存在著代謝冗余機制（metabolic redundancy），只有極少數酶是其代謝所必需的。因此抗感染的藥物所能針對的目標代謝途徑很有限。
關于體內病原微生物的蛋白質組學早期的發展，Schmidt 等已在 2011 年進行了綜述[33].當前這一領域最大的不足之處是與體外培養相比，鑒定到的蛋白數量還相對較少，通常只有幾百個蛋白，覆蓋率僅10% ~20%（圖1）[35 ~37].這對于從蛋白組數據中分析病原微生物入侵后采用的分子機制，發掘具有重要生物學意義的結果是遠遠不夠的。
隨著胞內病原微生物分離過程的優化及更高靈敏度的液質聯用平臺的應用，從數量極其有限的胞內微生物中進行高覆蓋率蛋白組分析逐漸成為可能[38-40].空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni）是一種重要的造成食源性疾病的細菌。Liu 等通過定量蛋白組分析感染 COS-1 細胞的空腸彎曲菌蛋白組。他們采用離心方法分離胞內細菌，取得了較好的分離效果（宿主細胞干擾小于 15%）[40],鑒定到 1428 個蛋白，覆蓋率達到 86%.通過高覆蓋率的體內蛋白組數據，他們發現空腸彎曲菌入侵宿主細胞后，代謝水平發生了顯著下降，并且重新調整了呼吸模式，更傾向于采用富馬酸作為電子給體。他們的結果有助于人們針對胞內病原微生物特殊的代謝途徑發展應對策略。
Pieper 等采用類似方法研究了另一種重要病原微生物---志賀氏菌在宿主細胞體內的蛋白組變化[38].他們采用超速離心的方法分離體內細菌，對比了體外培養，胞內和與細胞共同培養但不具備入侵能力的志賀氏菌的蛋白組。定量蛋白組數據表明志賀氏菌在宿主細胞內所用的主要碳源發生了明顯變化，并且與攝取鐵離子相關的蛋白發生了明顯上調，相關蛋白突變體的進一步驗證表明感染后志賀氏菌在宿主體內的增殖依賴于其獲取鐵離子的量。
絕大多數對于病原微生物的研究都以在體內實驗獲得在感染過程中的相關機制作為最終的目標，關于病原微生物的蛋白組研究同樣如此。相信隨著體內病原微生物分離和蛋白質組學液質聯用平臺的進一步發展，將實現在體內鑒定到與體外培養條件下數量相近的蛋白。從而通過更具深度和廣度的蛋白質組學數據，給出病原微生物感染宿主后啟動的重要分子機制，并為特異性抑制感染提供新思路。
3 感染過程中宿主的蛋白質組學
與病原微生物相對簡單的蛋白組相比，宿主通常是高等真核生物，其基因數量和翻譯出的蛋白組的復雜度均遠遠高于前者。對宿主細胞進行高通量高覆蓋率的定量蛋白質組學分析在技術上是更大的挑戰。
對宿主蛋白表達組的研究可按照分析的宿主蛋白目標不同，分為蛋白表達組（包括全蛋白組、亞細胞蛋白組）和修飾組兩類。亦可根據實驗條件的不同分為兩類：以病原微生物的某些模型代謝產物（如革蘭氏陰性菌的脂多糖）或病原菌組成部分（如鞭毛）刺激；以病原微生物（野生型或基因缺陷型）感染。
3. 1 表達組
Dhungana 等應用脂多糖刺激巨噬細胞，采用穩定同位素氨基酸代謝標記（ stable isotope labeling byamino acids in cell culture,SILAC） 進行蛋白定量[41].泛素-蛋白酶體系統在脂多糖刺激后重新分布到脂筏區（lipid raft region）；MEK-ERK 通路的激活也對蛋白酶體激活有調控作用。
Du 等采用 SILAC 定量研究了 LPS 刺激僅 10 分鐘后的宿主細胞蛋白組[42].通過亞細胞分離，有效分離出胞漿和細胞核兩個組分，從而提高了蛋白組鑒定的深度和廣度。胞漿和細胞核中各有 611 和758 個蛋白在 LPS 刺激 10 分鐘后表達量發生顯著變化。通過通路分析，他們發現 MAPK 和 NF-κB 通路在刺激 10 分鐘后即發生了顯著變化，說明宿主細胞對于病原微生物的應激反應是十分迅速的。
中性粒細胞（neutrophil）是免疫系統的重要組成部分，而中性粒細胞網具有降解效應蛋白、消滅革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽性菌的作用。Urban 等提取并分析了中性粒細胞網的蛋白組成，發現了 24 個與中性粒細胞網相關的蛋白[43].他們在其中發現了鈣衛蛋白（calprotectin）。進一步的體外和體內實驗表明，鈣衛蛋白確實參與了中性粒細胞網的形成。
Hardwidge 等分析了野生型和三型分泌系統（ typeⅢ secretion system）缺失的突變型致病性大腸桿菌（Enteropathogenic Escherichia coli）感染后 Caco-2 細胞系的蛋白組[44].在鑒定到的 2090 個宿主蛋白中，264 個的表達量有顯著差異。
Backert 等則結合轉錄組學與蛋白質組學的手段分析野生型及缺失四型分泌系統的幽門螺旋桿菌感染后的人胃上皮細胞[45].他們采用二維凝膠電泳分離，鑒定到 190 個發生顯著變化的蛋白。其中161 個蛋白在感染后 mRNA 水平發生顯著變化。他們的工作驗證了四型分泌系統在幽門螺旋桿菌感染過程中的重要作用。
Meissner 等人分析了脂多糖刺激后小鼠巨噬細胞的分泌蛋白組[46].他們的研究包括 5 個不同的時間點和 4 種基因型的小鼠（WT/MyD88-ko/Trif-ko/MyD88-ko &Trif-ko），并同時分析了分泌組和巨噬細胞轉錄組的變化。在受到 LPS 刺激后，免疫細胞分泌蛋白組發生了極其顯著的變化，部分蛋白分泌量的變化超過了 1000 倍。而敲除兩個 TLR4 重要的接頭蛋白 MyD88 或 Trif 后，巨噬細胞對于刺激的響應明顯減弱。除了證明兩個接頭蛋白對于 TLR4 的信號傳遞通路引起的下游分泌蛋白的變化具有重要作用外，作者還通過對比單雙敲除體的實驗結果證實，兩個接頭蛋白對下游分泌蛋白的調控具有冗余作用、協同作用等幾種不同的方式。
3. 2 修飾組
除了表達量不同，不同的翻譯后修飾也會極大地影響蛋白質的功能[47].Sharma 等研究了脂多糖刺激不同時間后巨噬細胞的磷酸化蛋白組[48].大約 140 個磷酸化位點（175 個磷酸化肽）在 LPS 刺激后發生了顯著變化。大規模磷酸化蛋白組的實驗結果對于發現 TLR4 通路相關蛋白有著重要作用。另外，通過生物信息學分析結合時間分辨的磷酸化蛋白組數據，人們對于 LPS 刺激后的巨噬細胞的不同時間、空間上不同細胞器相關蛋白的響應有了新的認識。
Rogers 等研究了沙門氏菌感染后宿主細胞磷酸化蛋白組的變化[49].通過未感染/野生型感染/缺失效應蛋白 SopB 的沙門氏菌的對照，他們從系統層面研究了效應蛋白 SopB 對宿主磷酸化蛋白組的影響，實驗表明感染后宿主細胞磷酸化水平的變化之中有大約一半與 SopB 有關，說明 SopB 對于宿主細胞信號轉導有著廣泛的調控。
在對感染過程中宿主細胞蛋白組的研究方面，以下幾個問題受到廣泛關注[50]:宿主細胞對病原微生物的感受機制及受體蛋白；病原微生物效應蛋白在宿主細胞內的作用目標；病原微生物引起的宿主細胞信號傳遞鏈的變化；宿主細胞的免疫相關反應（如抗體的產生、免疫相關信號通路和分泌蛋白的變化）等。
4 總結和展望
隨著病原微生物蛋白質組學技術的發展，早期圍繞著體外培養病原微生物和蛋白鑒定的工作已經不再成為主流，而研究感染后體內病原微生物和宿主細胞的工作在近幾年不斷增加。通過在系統層次高通量高覆蓋率分析感染后病原微生物和宿主蛋白組的變化，我們將更加深入地認識在感染過程之中二者分別使用的主要分子機制。另外，結合多種蛋白質組學手段（如修飾組、分泌組、蛋白相互作用組）及上下游組學手段（轉錄組、代謝組）并互相對照[9,28,46],也會極大地推動人們對于病原微生物感染過程的認識。最終，以后續生物學實驗進一步驗證前期組學實驗得到的初步結論及其功能，也將進一步促成蛋白質組學從產生組學數據向解答重要生命科學問題的重要轉變。
參考文獻：
[1] Neidhardt F C. Proteomics,2011,11（15）：2943[2] O'Farrell P H. J Biol Chem,1975,250（10）：4007
[3] Wilkins M R,Pasquali C,Appel R D,et al. Nat Biotech,1996,14（1）：61
[4] James P. Quarterly Reviews of Biophysics,1997,30（4）：279
[5] Aebersold R,Mann M. Nature,2003,422（6928）：198
