纖維素乙醇被稱為第二代生物燃料技術，它以木質纖維素類生物質為原料，而農作物秸稈是該類生物質的重要來源之一。 我國年產秸稈 6.98 億 t,其中玉米秸稈 1.71 億 t,約占秸稈總量的 1/4[1],目前秸稈的利用率偏低。 預處理、酶解、發酵是纖維素乙醇煉制過程中的 3 個關鍵技術環節，預處理是克服木質纖維素原料的酶解頑抗性的必要手段[2-3]. 預處理方法主要有：酸法、堿法、水熱法、蒸汽爆破法和氨纖維爆破法等[4-5]. 預處理效果通過酶解率、預處理成本、是否產生毒害酶解或發酵的抑制劑、環境危害等因素來判斷。 我國學者圍繞纖維素乙醇研究對玉米秸稈采用了酸法[6]、堿法[7]、水熱法、汽爆法[8]、微波與酸化汽爆[9]等多種預處理方式，進行了預處理和酶解的相關試驗研究，纖維素與半纖維素的 72 h 酶解率分別在 80%和 60%左右。 國外學者圍繞玉米秸稈的預處理與酶解糖化的研究更為細致而全面[4-5],并重視預處理過程中的物理化學變化、木質素移除與轉化等促進酶解的機理方面的研究[10-12].

對比預處理研究文獻，以氨為介質的預處理方法對于玉米秸稈具有較好的預處理效果。 氨是一種價格低廉的堿性原料，其水溶液或純液氨可用于預處理。 氨水預處理主要代表方法是氨回收滲濾法（ammonia recycle percolation,ARP），又可根據處理溫度、氨含量與水分不同，細分為 ARP 法[13]、SAA 法（soaking in aqueous ammonia）[14]和 LMAA 法（low-moisture anhydrous ammonia）[15]等，但它的處理周期長，如 ARP 法長達 10~60 d. 液氨主要用于氨爆法或氨纖維膨脹法（ammonia fiber expansion,AFEX），處理后的玉米秸稈在添加纖維素酶 15 FPU/（g 葡聚 糖）時 168 h 的葡 聚糖和木聚糖的酶解率達到 95%和 80%以上[16],酶解效果非常好。

本研究在 AFEX 的基礎上提出了 LAT 法，采用液氨加溫處理，預處理溫度范圍加大，但不采用快速釋放氨氣的爆破法。 AFEX 過程基本上不產生酶解與發酵抑制劑和環境危害物[16],本實驗與之相近。 因此對 LAT 預處理后玉米秸稈的酶解效果與酸、堿、熱水、汽爆、AFEX 等預處理方法進行了對比。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

玉米秸稈（糯玉米）采自福建省三明市（東經 117.35°、北緯 26.13°），采收期為 7 月份（播種至青穗采收約 65 d）。 實驗采用地上部分的整株植物，將其切割成約 1~2 cm 長條狀，初曬后經 40 ℃烘干至含水率低于 15%,用 FZ102 微型植物粉碎機粉碎成 50~100 目粉末。 經混合均勻后采用水分分析儀 MA35（賽多利斯）測得其含水率，并用塑料袋密封后置-20 ℃冰箱中存放備用。

用于高效液相色譜（HPLC）分析的對照品的葡萄糖、木糖等均采購自 Sigma-Aldrich 公司，純度為 99%以上；預處理用的氨采購自杭州龍山化工有限公司。

添加的水解酶為纖維素酶 （novozyme NS50013）、β-葡萄糖苷酶 （novozyme NS50010）， 由諾維信（中國）有限公司提供。 NS50013 纖維素酶的活性由濾紙法測定 ,它是一種混合酶，具有木聚糖酶活性，故實驗中未添加木聚糖酶。

1.2 方法

實驗分析方法參照了美國國家可再生能源實驗室（National Renewable Energy Laboratory,NREL）制定的實驗規程（Laboratory Analytical Procedure,LAP）[17],并減 少了酶制劑的添加量 （由 60 FPU/（g葡聚糖）改為 15 FPU/（g 葡聚糖）），加大了反應容量（由原規程中的 10 mL 增加為 15 mL）。

1.2.1 組分測定玉米秸稈中碳水化合物和酸不溶性木質素（Klason 木質素）采用酸水解法測定，碳水化合物組分由 LAP002 方法測定，酸不溶性木質素由 LAP003 方法測定。 LAP002 和 LAP003 采用二步酸解法，在一次實驗中完成。

酸水解的具體步驟是先用分析天平稱量已知含水率并去除抽提物的秸稈原料約 0.3 g, 加入72%硫酸 3 mL,在 30 ℃水浴中保持 2 h,加去離子水 84 mL（稀釋至 4%硫酸），放入滅菌鍋中 121 ℃保持 1 h.經真空過濾后將濾紙上的固形物烘干至恒重，用 HPLC 法（色譜分析柱采用 BioRad 醇酸柱HPX-87H）測定各種單糖的含量，并折算成葡聚糖（纖維素）、木聚糖、阿拉伯聚糖等比例，由濾紙上的固形物質量與灰分測定來確定不溶性木質素含量。

灰分測定采用 LAP005 規程，用分析天平稱量 1 g 左右已知含水率的原料，將其放入已測定質量的有蓋陶瓷坩鍋中，置入箱式電阻爐中程序緩慢升溫，約 2 h 后升至 575 ℃，保持此溫度 4 h 以上。 冷至 105 ℃時將坩鍋取出放入干燥器，冷卻后稱量質量并計算灰分。

1.2.2 液氨預處理（LAT 法）LAT 法預處理：根據原料確定反應用量，將確定量的液氨注入移液鋼瓶 （300 mL），并 加熱小鋼瓶至 50 ℃左右；將待處理的已知含水率的原料放置在反應器（改裝的高壓反應釜，大連自控設備廠）中，并將反應器抽成真空；然后將氨注入反應器，加熱反應器到預定溫度；在預定溫度下駐留一定的時間，而后氨被釋放（約 30 s），即預處理過程完成。 取出處理原料置于通風柜中讓處理后原料中的氨逸出，然后在烘箱中低于 40 ℃干燥。 稱重并測得含水率，計算預處理后生物質原料得率，將處理后的原料放入-20 ℃冰箱冷藏備用。

LAT 預處理優化的工藝參數選擇分別為：預處理的溫度、含水率、駐留時間等 ,另外氨用量也可以作為參數供優化。

1.2.3 酶水解酶水解參照 LAP009 的相關規程進行，酶解液總量為 15 mL,每組樣品酶解至少做一組重復。 根據規程，酶解采用 1%葡聚糖當量，即稱取 0.15 g 葡聚糖當量的秸稈放入酶解瓶（20 mL 樣品瓶），依次加入蒸餾水、檸檬酸鈉緩沖溶液（平衡后 pH 值為 4.8）、抗生素（四環素和環己酰亞胺），經預混合1h 后添加纖維素酶、β-葡萄糖苷酶。 每克葡聚糖當量的生物質原料中添加纖維素酶 15 FPU/（g 葡聚糖）、β-葡萄糖苷酶 64 pNPGU/（g 葡聚糖）。 酶解條件是溫度設定為 50 ℃，搖床轉速為 150 r·min-1.酶解取樣時間分別為 24、72 h.酶解取樣 1 mL 放入離心管，放置加熱器（設置溫度 99 ℃）中加熱 20 min,使酶蛋白變性失效，放入-20 ℃冰箱冷卻 5 min,再放入離心機（艾本德 5424,設置轉速 14500 r·min-1）離心 5 min,經 0.22μm 一次性針頭過濾器過濾（聚醚砜膜）后轉入 HPLC 分析瓶，放入 4 ℃或-20 ℃冰箱冷藏待分析。

1.2.4 單糖的測定酸解或酶解液中糖的定量分析用 HPLC 法， 設備為帶示差檢測器的 Agilent Technologies 1200系列色譜儀。 采用 BioRad 公司的 HPX-87H 色譜柱（該色譜柱可適用于中性或酸性溶液），流動相為0.005 mol·L-1稀硫酸，流速為 0.60 mL·min-1,柱溫為 50 ℃。

1.2.5 酶解率計算酶解轉化率（酶解率）為實際獲得單糖含量與理論最高可得單糖含量之比，而理論最高可得單糖根據原料中經組分分析（二步酸解法，LAP002）的聚糖含量進行折算。 以葡聚糖的酶解率為例，其計算公式是：【1】

酶解率 d 為百分數，式中分子為酶解所獲得葡萄糖含量折算成葡聚糖的量，其中 g 為酶解液中葡萄糖的含量 （單位為 g/L），15 為酶解液的體積，162/180 為化學式中葡萄糖因聚合失去一個水分子的比例； 分母為理論上加入的葡聚糖量，b 為加入的原料干基質量，c 為組分分析（酸解法）葡聚糖含量。

2 結果與討論

2.1 原料成分分析

原材料的組分如表 1 所示，碳水化合物和木質素含量通過二步酸解法分析獲得，灰分通過箱式電阻爐加熱分析獲得。 秸稈中葡聚糖（纖維素）和木聚糖的含量合計為 56.21%,這是理論上可以轉化為單糖的聚糖主要來源。

2.2 預處理溫度對酶解效果的影響

預處理溫度對酶解率的影響如圖 1 所示， 橫坐標為預處理溫度，即預處理加熱到此溫度下并保留一定時間的溫度（實驗過程中溫度波動范圍為±5 ℃）；葡聚糖/木聚糖的轉化率用柱狀圖表示（左側縱坐標），每千克干基秸稈原料獲得的單糖量為點線圖（右側縱坐標）。 本實驗固定液氨與原材料（干基）質量比為 1∶1, 其他預處理條件預設為含水率 60%、預處理駐留時間為 5 min. 在 70℃~130℃范圍內，葡聚糖酶解率的總體變化趨勢是隨著溫度升高而增加，在 90 ℃后，提升更趨緩慢； 木聚糖酶解率在 90 ℃有較大值，110 ℃有所下降，130 ℃又有提升。 單糖總體得率隨著溫度升溫而略有上升，90 ℃時葡聚糖和木聚糖的轉化率分別為 86.0%和79.2% , 每千 克干基秸稈可得單糖 524.7g, 轉化率約為理論最高轉化率的 83.3%;130 ℃時葡聚糖和木聚糖的轉化率分別為91.8%和 82.1%,可得單糖 554.4 g,轉化率約為理論量高轉化率的 88.0%.LAT 預處理的優化溫度略高于 AFEX 預處理，AFEX 預處理用于玉米秸稈的優化溫度為 90 ℃[16],而 LAT 預處理在 90~130 ℃均具有較好的效果。LAT 預處理后的酶解率與 AFEX 相當，AFEX 在優化條件下，添加纖維素酶 15 FPU/（g 葡聚糖）的 72 h 葡聚糖和木聚糖的酶解率分別為接近 90%和 70%[18],本研究中的 130 ℃預處理后的酶解效果優于 AFEX.

2.3 預處理含水率對酶解效果的影響

預處理含水率是指預處理前物料的含水率，采用的是水分與干基物料的比例（此處為干基水分含水率），含水率對玉米秸稈葡聚糖和木聚糖的酶解率的影響如圖 2 所示。 實驗中含水率分別采用20%、40%、60%、80%,其他反應條件為 90 ℃、氨與 秸稈質量比為 1∶1,反應時間為 5 min. 在實驗區間范圍內，含水率在 60%時具有最高的轉化率，此時葡聚糖和木聚糖 72 h 酶解率分別為 85.97%和79.15%,每千克秸稈可得單糖 524.7 g.預處理前含水率的變化對酶解效果的影響與 AFEX 用于玉米秸稈的情形相近，為 60%[18];但與芒草等作物存在差異，芒在 AFEX 中最佳含水率出現在 80%和 200%[19],LAT 法在其他類生物質原料中的應用有待進一步研究。

2.4 預處理駐留時間對酶解效果的影響

LAT 預處理駐留時間對酶解效果的影響如圖 3 所示，實驗駐留時間分別為 3、5、10 min,其他條件為 90 ℃、含水率 60%、氨與原料比為 1∶1.葡聚糖和木聚糖的轉化率在駐留時間 3~10 min 范圍內，轉化率呈先上升后下降的趨勢，在駐留時間為 5 min 時達到峰值。 隨著預處理時間加長，可能是聚糖或單糖分解導致酶解率下降，其原因待進一步分析。

2.5 質量平衡

預處理與酶解的質量平衡流程圖如圖 4 所示。 采用的預處理條件為：預處理溫度 130 ℃、含水率 60%、駐留時間為 5 min、液氨與生物質比例為 1∶1,纖維素酶添加量為 15 FPU/（g 葡聚糖），72 h葡聚糖和木聚糖的酶解率分別為91.8%和 82.1%,1000 g 干基 玉米秸 稈 經 預 處 理 后 固 體 得 率 為95.35%,72 h 酶解后可獲得單糖524.3 g （僅計算葡萄糖和木糖），而未作預處理的單糖獲得量為228.3 g,預處理后單糖得率是未處理原料的 2.1 倍。 從質量分析中可以看出，木糖在酶解轉化中占了相當大的比例，約占總糖量的 36%. 如何使木糖在預處理過程中不被降解，并且在后續發酵過程中充分轉化為乙醇（采用基因工程改造的菌種），這在纖維素乙醇研究中非常重要。 同時，質量平衡在預處理方法對比過程中非常重要[20],也值得研究者充分關注。

2.6 預處理效果比較

國外學者采用氨水預處理的 ARP 法和 SAA（法，葡聚糖的 15 FPU/（g 葡聚糖）、72 h 的酶解率分別為 88.5%[13]和 92.5%[14], LMAA 法乙醇的理論得率為 90%[15]. AFEX 法預處理用于玉米秸稈的酶解率比較高，一般在 90%左右[16,18]. LAT 和 AFEX 法由于采用的是液氨，未參與反應的氨可以再利用或回收，有利于降低成本和環境保護。

不同的預處理方法用于玉米秸稈，酶解效果存在較大的差異。 如酸預處理，采用乳酸或乙酸及混合預處理，這 3 種方法的葡聚糖的轉化率為 83.92%~94.28%,木聚糖的轉化率 58.78%~81.08%[21];玉米秸稈經 1%稀硫酸溶液浸潤后經 121 ℃處理 60 min,72 h 后原料的酶解率為 62.5%（纖維素酶添加量 6 FPU/（g 葡聚糖））[6]. 如堿預處理，預處理條件為 1.5%NaOH,80 ℃下反應 1 h 時，48 h 纖維素酶解率 71.29%,半纖維素酶解率 78.85%,總糖得率比未處理樣品提高 46.66%[7]. 水熱法預處理后48 h 酶解率為 63.13%[8]; 汽爆預處理后纖維素與半纖維素酶解率分別為 81.5%和 55.3%（纖維素酶添加量為 10 FPU/（g 葡聚糖），144 h 酶解）[22];采用微波和酸化汽爆的優化條件下預處理 ,在添加纖維素酶 12 FPU/（g 葡聚糖）時，葡聚糖的轉化率分別為 47.5%和 62.5%[9]. LAT 預處理在優化條件下，葡聚糖與木聚糖的酶解率分別為 91.8%和 82.1%,與酸、堿、熱水、汽爆等預處理方式相比，酶解率相對較高。

3 結論

通過對玉米秸稈的 LAT 預處理和酶解糖化過程的實驗研究，有如下結論：

（1）LAT 預處理能顯著提高玉米秸稈原料的酶解率，預處理原料經酶解后的單糖產量是未經預處理的 2.1 倍，LAT 法預處理后的酶解率和單糖得率高于酸、堿、水熱和汽爆法等。

（2）LAT 法預處理的優化條件是預處理溫度為 90~130 ℃、含水率為 60%（干基）、預處理駐留時間為 5 min. 在此優化條件下（130 ℃），在纖維素酶添加量為 15 FPU/（g 葡聚糖）時，玉米秸稈中的葡聚糖和木聚糖 72 h 酶解率分別為 91.8%和 82.1%,每 kg 干基秸稈可得單糖 524.3 g.

（3）溫度、含水率和駐留時間都對預處理的效果有影響，而溫度的影響為最大。

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