視神經是視覺傳導的通路，屬中樞神經，由視網膜節細胞發出的神經纖維及神經膠質細胞組成，不含神經元胞體，因此常用作中樞神經損傷再生研究較理想的實驗材料[1、2],但有關不同發育階段大鼠視神經的變化目前還未見系統報道。本研究從組織形態學的角度，采用常規HE及免疫組織化學染色，結合電鏡技術，通過對不同發育階段大鼠視神經的觀察，以期揭示其變化規律，為進一步進行有關視神經的研究提供實驗資料。
1 材料和方法
1.1 動物及主要試劑來源
實驗動物由第三軍醫大學動物實驗中心提供成年Wistar品系大鼠，種鼠按雄：雌1∶2籠養交配，次晨檢查出現陰栓為妊娠零天。
實驗試劑為抗CNPase單抗（2′3′-cyclic nucleotide 3′-phosphohydrolase,CNPase,Promega公司）用于標記整個發育階段的少突膠質細胞，抗GalC（Galactocere-broside GalC,Sigma公司）多抗用于標記成熟的少突膠質細胞?？鼓z質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acid-ic protein,GFAP,重慶醫科大學）單抗用于標記星形膠質細胞。
SP免疫組化試劑盒為北京中山公司產品。
1.2 分組與檢測方法
1.2.1動物分組及取材按產后（postnatal）0、3、5、8、15、20、90天平均分成7組，分別命名為P0d、P3d、P5d、P8d、P15d、P20d及P90d,每組4只。其中HE染色、抗CNPase、GalC和GFAP免疫組化染色2只，電鏡2只。動物斷頭后1分鐘內用顯微手術器械于視交叉向前一直達眼球完整取出視神經。電鏡標本放入3%的戊二醛中固定，HE及免疫組化染色標本放入4%的多聚甲醛/PB中固定，常規石蠟包埋切片。
1.2.2免疫組化染色觀察操作步驟按說明書進行，只作少許修改，即 石 蠟 切 片 常 規 脫 蠟 至 水，3%H2O2/甲醇10min,PBS洗3min×3次，7%山羊血清/PBS室溫孵育30min,CNPase（1∶1000）單抗，GalC多抗（1∶100）及GFAP單抗（1∶100）4℃過夜，PBS洗5min×3次，生物素化IgG（1∶200）37℃6h,PBS 5min×3次，HRP標記的鏈霉卵白素（1∶200）37℃2h,PBS5min×3次后，DAB顯色光鏡觀察。
1.2.3發育大鼠視神經HE染色按常規進行電鏡觀察、常規包埋后切片，電子染色，透射電鏡觀察。將HE染色及GFAP和CNPase、GalC染色結果照相，然后換算成相同放大倍數（×200），每張照片（5寸）分別隨機統計4個相同面積（4cm2）內陽性細胞數，每種染色在相同時相點統計兩張照片（n=8），統計時按照體視學的原則，對于統計格內框格線上的細胞進行數上不數下，數左不數右；HE染色切片則統計相同情況下藍染細胞核的數目，以此作為視神經內膠質細胞的總數。
1.3 統計學分析
所得數據用SPMR數理統計程序包在 計 算 機 進 行 雙 因 素 方 差 分 析，所 用 程 序 為MANOVA,結果以珚x±s標準差表示，P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1電鏡觀察
大鼠出生后1天的視神經內細胞排列不規則，核多呈圓形，有的細胞內胞漿較豐富，粗面內質網、線粒體及高爾基氏體較發達，異染色質相對較多；另有一些細胞質內電子密度相對較低，有時可見成束的膠質原纖維，細胞核相對較大，異染色質相對較少，此類細胞相對較前一類為多。細胞間有大量的軸突，不見明顯的髓鞘形成。出生后3天，細胞的數量有所增加，細胞的排列趨于規則，即細胞沿視神經長軸平行排列，與纖維相間。胞體稍有增大，胞質內細胞器仍較豐富，異染色質較多的細胞比例有所增加，軸突似可見單層的髓鞘。出生后5天，異染色質較多的細胞明顯增多，細胞排列更規則，胞質顯著減少，胞核拉長變扁，纖維區出現散在髓鞘包繞的軸突（見圖1）。以后這種變化越來越明顯，到出生后3月，可見細胞體積相對較小，胞質內仍可見較多的高爾基氏體和豐富的粗面內質網；細胞核長方形，常偏位；軸突均為髓鞘所包繞，已少見到胞質內有膠質原纖維的細胞，見圖2.
2.2 HE染色光鏡觀察
大鼠出生后1天，視神經組織內細胞散在，較少，排列不規則；出生后3天，細胞數量明顯增多（見圖3）；出生后5天，細胞排列漸規則，細胞數量的增幅明顯減??；至出生20天后細胞排列規則，見圖4.
2.3 CNPase及GalC免疫組化染色
大鼠出生后1天，視神經內均未見GalC免疫染色陽性細胞，而只有極少數的CNPase免疫反應陽性細胞，排列不規則（見圖5）。到出生后5天，兩種抗體均為陽性的細胞數已顯著增多，排列也趨于規則，于出生后15天，細胞數量的增長已顯著放慢，并沿視神經的長軸平行排列，見圖6.
2.4 GFAP免疫組化染色
大鼠出生后前3天，有較多的GFAP免 疫 反 應 陽 性 細 胞 （見 圖7）,8天 后，GFAP免疫反應陽性細胞數量較新生大鼠顯著減少，到出生后3月，GFAP免疫反應陽性細胞已較少見到，見圖8.
2.5 不同發育階段視神經內兩種大膠質細胞的統計學變化
大鼠出生后3天，視神經內細胞總數較出生時有顯著增加（P<0.05），以后其增加速度迅速減慢，但成年大鼠視神經內的細胞數較出生后20天仍有一定程度的增長。
CNPase免疫反應陽性細胞在出生后3天顯著增加（P<0.05），同時，GalC免疫反應陽性細胞也迅速增加（P<0.05），到出生后20天，相同面積內CNPase免疫反應陽性細胞數與GalC免疫反應陽性細胞數已無顯著差別（P>0.05）。相反，GFAP免疫反應陽性細胞雖然在出生后3天有一定程度的增加，但出生5天后其數量即迅速減少，至成年后便維持在一定水平，見表1【1】
3 討論
中樞神經系統膠質細胞的分類復雜，根據其大小、形態、功能及免疫學特性就可分為很多種。其中兩種大膠質細胞，少突膠質細胞和星形膠質細胞，在中樞神經系統中所占的比例最大，且生物學作用也非常重要。因此，本研究主要就這兩種膠質細胞進行了觀察。
目前，鑒定星形膠質細胞及少突膠質細胞的方法也有多種，包括光鏡及電鏡方法。電鏡對組織結構的細微變化觀測有著不可替代的優越性，通過對電鏡下某些細胞所表現出的特征性結構的認識，可以達到對這些細胞進行初步定性的目的[3].而在光鏡下，免疫組化染色不僅可對細胞進行較準確的定性，從而對細胞進行較準確的分類計數，而且在一定程度上還可對細胞內某些代射產物進行定量檢測。本研究正是基于這樣的事實，綜合運用常規HE染色、免疫組化及電鏡技術，對不同發育階段大鼠視神經進行了比較系統的觀察。
本研究結果顯示，新生大鼠的視神經內可見大量平行排列的視網膜節細胞軸突，不見明顯的髓鞘形成，其 髓 鞘 是 在 出 生 后5天 才 逐 漸 形 成 的，這 與Schwab等（1989）在皮質脊髓束中觀察到的基本一致。視神經中各細胞成份的統計學顯示，視神經中相同面積內的細胞總數在出生后的最初3天變化比較明顯，即在出生后3天之內，細胞總數迅速增加，以后則變化明顯放慢。同時，視神經中兩種主要的細胞成份少突膠質細胞及星形膠質細胞的數量各自向著相反的方向變化，即在較短的時間內少突膠質細胞的數量迅速增加，而星形細胞的數量迅速減少。在出生后3天，視神經中不僅CNPase免疫反應陽性細胞數迅速增加，而且還出現了較多GalC免疫反應陽性細胞（P<0.05），這種GalC免疫反應陽性細胞隨著視神經的發育成熟，其比例也逐漸接近CNPase免疫反應陽性細胞，也就是說，視神經不斷發育成熟伴隨著少突膠質細胞的發育成熟[5,6].
早些時候Jakson[7]及Dentinger[8]等采用先在光鏡下數單位面積內細胞的總數，再在電鏡下鑒定細胞類型的方法對發育大鼠視神經內各細胞成份的變化進行了類似的研究。其結論是：視神經在出生后的發育中細胞的總數有逐漸減少的頃向，并認為少突膠質細胞的比例在出生后雖迅速增加，但星形細胞卻終保持著較高的比例，在成年動物差不多為1∶1,這與本實驗結果有較大的偏差。
Burne等[9]直接在電鏡下進行細胞分類計數，結果是少突膠質細胞：星形膠質細胞為2∶1的比例。也有研究發現，隨著視神經的發育成熟，神經纖維會逐漸減少，髓鞘形成細胞逐漸增多[10].
筆者認為，這與其計數及鑒定方法有關。由于電鏡的放大倍數較大及少突膠質細胞多形性，因此，很難對細胞進行比較精確地計數。本實驗采用少突膠質細胞及星形膠質細胞特異性標記物對細胞進行免疫組織化學染色并在光鏡下觀測，極大地避免了分類上的誤差；另外，考慮到在視神經的發育過程中，隨著視神經髓鞘的形成，其直徑也要增粗，因此，在統計相同面積內的細胞數時，用視神經的直徑對這些數字進行修正，從而更真實地反映了發育大鼠視神經中各細胞成份的變化規律。
4 結論
本研究從組織形態學上初步闡明了發育大鼠視神經的變化規律，即視神經發育成熟的過程是由少突膠質細胞逐漸形成髓鞘的過程，這一結果可為有關視神經的研究提供實驗資料?！酒渌鼒D略】
