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首頁 > 化學論文 > > 含保護液的L-酪氨酸和丙氨酸合成二肽的方法設計
含保護液的L-酪氨酸和丙氨酸合成二肽的方法設計
>2023-11-19 09:00:01



酪氨酸是維持細胞生長必備的氨基酸之一,而丙酪二肽作為一種新型培養基的組成成分,其合成方法多為酶促合肽[1-3],雖然反應效率較高,但由于酶的專一性和成本較高,不利于工業化。本文設計用甲醇保護的 L-酪氨酸和氯甲酸芐酯保護的丙氨酸反應生成帶保護基團的二肽,再通過堿解和加氫脫去保護基團,合成路線見圖 1,該方法反應條件溫和,原材料價格低廉,具有一定的工業化價值。


1、試驗部分

1.1 試驗試劑與儀器。
試劑:L-丙氨酸和 L-酪氨酸,1-羥基苯并三氮唑 (HOBt),1-乙基 -(3-二甲基氨基丙基 ) 碳酰二亞胺鹽酸鹽 (EDC-HCl),純凈水為飲用水,其余試劑均為市售工業試劑。
儀器:LC-10ATVP 液相色譜儀測定,TENSOR27 型傅里葉變換紅外光譜儀 (KBr 壓片 ),LC-MS-2010EV 質譜儀,Avanceav 500 型核磁共振儀 (CDCl3溶劑,TMS 內標 )。
1.2 實驗步驟。
1.2.1 酪氨酸甲酯鹽酸鹽 2 的制備。
向 1L 體系中加入甲醇 600mL,冰鹽浴降溫至T<0℃,緩慢滴加氯化亞砜31.6g,控溫T<0℃反應,滴畢,向體系加入 L-酪氨酸 40g,繼續攪拌,撤去冰鹽浴,緩慢加熱至回流 2h,降溫至T< 50℃,減壓濃縮得黃色粗品 82g;甲醇 / 甲基叔丁基醚重結晶,得白色固體 42g,收率 82%,LC 純度 99%.
1.2.2 Cbz 保護丙氨酸 3 的制備。
向 2L 體系中加入 L-丙氨酸 89.0g,12% 氫氧化鈉溶液 900mL,冰鹽浴降溫至體系T< 0℃,緩慢滴加氯甲酸芐酯 340g,滴畢自然升溫至室溫反應,不斷補充氫氧化鈉溶液,保持體系 pH ≈ 12 反應,至pH 無變化,緩慢加入 18% 鹽酸溶液至 pH ≈ 8,加入乙酸乙酯洗滌水相至澄清,繼續緩慢加入 18% 鹽酸溶液至體系 pH < 1,乙酸乙酯 1200mL 提取水相,無水硫酸鈉干燥,過濾,濾液減壓濃縮得白色粗品300g;乙酸乙酯 / 石油醚重結晶得白色固體 182g,收率 81%,LC 純度 94%,ESI-MS(m/z):(222,M--H)。
1.2.3 Cbz 保護丙氨酰酪氨酸甲酯 4 的制備。
向 1L 體系中加入酪氨酸甲酯鹽酸鹽 39.3g,Cbz保護丙氨酸 45.0g,HOBt 32.4g,四氫呋喃 750mL,冰鹽浴降溫至體系T< -5℃,緩慢滴加三乙胺 20.2g,滴畢,控溫T< 0℃繼續攪拌 30min,加入 EDCl45.8g 控溫T< 0℃反應,繼續攪拌 30min,撤去冰鹽浴,自然升溫至室溫反應,體系中少量固體不溶,繼續攪拌 16h,濃縮反應液得黃色粘稠固體 80g,溶入乙酸乙酯 800mL,分別用飽和碳酸氫鈉溶液和0.5mol/L鹽酸溶液分次洗滌,無水硫酸鎂干燥,過濾,濃縮得淺黃色粗品 70g;乙酸乙酯 / 石油醚重結晶得白色固體 55g,收率 80%,LC 純度 96%,ESI-MS(m/z):401, M+ + H)。
1.2.4 脫甲酯保護中間體 5 的制備。
向 500mL 體系中加入 Cbz 保護丙氨酰酪氨酸甲酯 35g,甲醇 350mL,加熱至 40℃溶清,冷卻至室溫,緩慢滴加 2mol/L氫氧化鈉溶液 220mL,滴畢,繼續攪拌 1h,緩慢加入 2mol/L鹽酸溶液調節體系 pH=8~9,濃縮除去甲醇,向剩余水液加入2mol/L鹽酸溶液調節體系pH<1,乙酸乙酯萃取,無水硫酸鎂干燥,過濾,濃縮得白色粘稠物 35g,收率 90%,LC 純度 91 %,ESI-MS(m/z):(387,M+ + H)。
1.2.5 L-丙氨酰-L-酪氨酸 1 的制備。
向 500mL 體系中加入脫甲酯保護中間體 522.0g,10% Pd/C 4.4g,甲醇和水的混合液 920mL,通H2( 約 0.1MPa) 反應 2h,過濾除去 Pd/C,濾液減壓濃縮得白色粗品 20g,甲醇和純凈水分別打漿 30min,過濾,得白色固體 17g,收率 77%,LC 純度 99%.
1.3 產品鑒定。
產品為白色晶體粉末,紅外圖譜如圖 2 所示,與分子結構相符;ESI-MS(m/z):(253,M+ + H);1NMR(D2O,500MHz),δ:7.1(d,2H);6.8(d,2H);4.4(m,1H);4.0(q,1H);3.1(dd,1H);2.9(dd,1H);1.5(d,3H)。

2、結論

本文所用氨基酸保護基材料低廉,合肽采用EDCl-HOBt 體系,后處理純化方法簡單且收率較高;加氫脫保護時用甲醇 / 水混合體系替代原有的單一溶劑體系,有效避免反應過程中產物析出附著 Pd/C催化劑導致其失活,優化后的反應體系加氫時間僅為 2h(常溫 20~30℃反應),反應完畢經簡單后處理純度即可達 LC > 99%.該合肽方法條件溫和,具有一定的工業化意義。

【參考文獻】
[1] Kenzo Yokozeki,Kanagawa, et al. Novel peptide-formingenzyme,microbe producine the enzyme and method forproducine peptide using them:US 2005/0032187[P], 2005-11-02.
[2] Ricca,Jean-Marc, et al. Selectivity and specificity insubstrate binding to proteases: novel hydrolytic reactionscatalysed by α-chymotrypsin suspended in organic solventswith low water content and mediated by ammonium hydrogencarbonate [J].J.Chem.Soc.Perkin Trans 1,1993(11):1225-1234.
[3] Bergmann Fruton, et al. The influence of substrate structureon the kinetics of carboxypeptidase action[J].J.Biol. Chem.,1942(145):247-252.

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