最近研究發現 , DACT 1（Dapper1/Dpr1） 基因是一個腫瘤相關基因 , 其在調節腫瘤細胞的生長、增殖、侵襲及轉移中起重要作用。有研究提示 , 在非小細胞肺癌中 DACT 1 的表達與腫瘤病理分級、大小、侵襲及轉移有關。鼻咽癌中DACT 1 的表達情況及其與鼻咽癌的發生、發展及轉移的關系還未見報道。本研究將通過改變 DACT 1 甲基化狀態改變其表達情況 , 觀察 DACT 1 基因在鼻咽癌細胞侵襲中的作用。
1材料與方法
1. 1細胞培養 CNE 2細胞購于中國生命科學院上海細胞所 , 在 5% 二氧化碳、37℃的條件下 , 用含 10% 胎牛血清的1640 培養基培養。在細胞處于對數生長期時用胰蛋白酶消化后分離 CNE 2 細胞 , 然后以等量接種在六孔板上 , 第 2 天 ,將六孔板中的 6 孔隨機分為兩組 , 一組用 S- 腺苷 -L- 甲硫氨酸處置 , 另一組不加任何藥物 , 藥物作用 1 d 后更換培養基繼續培養 , 2 d 后收獲細胞用于后續實驗。
1. 2甲基化特異性 PCR 上述細胞收獲后用 DNA 提取試劑盒提取各組細胞的 DNA, 然后用 DNA 甲基化試劑盒進行亞硫酸氫鹽修飾 , 根據 GeneBank 中 DACT 1 基因序列用甲基化引物設計軟件分別設計甲基化和非甲基化引物序列。甲基化引物序列 （M） :5-CGGGATAGTAGTAGTCGGC-3（S），5-CGCTAAAACTACGACCGCG-3（R）， 非甲基化引物（U）：5-GTTGGGATAGTAGTAGTTGGT-3（S）， 5-AAACACTAAAACTACAACCACA-3.分別用兩種引物對上述亞硫酸鹽修飾的各組細胞的 DNA 進行擴增 , 退火溫度分別是 60℃ （ 甲基化 ） 和58℃ （ 非甲基化 ）。分別取 PCR 產物 10 μl 用 2% 瓊脂糖凝膠電泳 , 觀察 DACT 1 基因甲基化情況。
1. 3RT-PCR 采用 TRIzol 試劑提取上述細胞的總 RNA, 用逆轉錄酶進行反轉錄形成DNA第一鏈（cDNA）。根據GeneBank中基因序列分別設計 DACT 1 和 β-actin 兩對引物 , 分別以cDNA 為 模 板 行 PCR.DACT 1 引 物 :5-GGAAGAGGACAGGCTTGGAAAC-3（S）， 5-GTCCCATTGTTCAGAGAAGGTATC-3（R）；β-actin引物：5-CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT-3,5-CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGC-3, 退 火 溫 度 均 是60℃。反應結束后取 PCR 產物 5 μl 用 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳 ,觀察 DACT 1 表達情況。
1. 4細胞侵襲實驗 （transwell 小室法 ） 將對照和加藥處理24 h 的細胞消化制成 105 個 /ml 懸液 , 取 1 ml 細胞懸液于1500 rpm 離心 5 min, 棄上清。加入 200 μl 無血清培養基 , 吹打均勻后放入 transwell 小室中。 Transwell 板中加入 500 μl含 10% FBS 1640 的完全培養基 , 將小室放入板中。37℃下于 5% CO2培養箱中培養 24 h.將小室取出 , 用 PBS 洗去培養基 , 結晶紫染色 10 min, 自來水將表面的結晶紫洗除干凈 ,用棉簽將上室中的細胞擦除干凈 , 于倒置顯微鏡下觀察 , 每組細胞隨機取 10 個視野記錄細胞數 , 分析觀察兩組細胞侵襲能力。
1. 5統計學方法 采用 SPSS17.0 統計學軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數 ± 標準差 （ x-±s） 表示 , 采用 t 檢驗；計數資料以率 （%） 表示 , 采用χ2檢驗。P<0.05 表示差異具有統計學意義。
2結果
甲基化特異性 PCR 結果顯示 , 未經 S- 腺苷 -L- 甲硫氨酸處理的CNE 2細胞中DACT 1基因是非甲基化的， 而經過S-腺苷 -L- 甲硫氨酸處理的 CNE 2 細胞中 DACT 1 基因是甲基化的 , 這說明 S- 腺苷 -L- 甲硫氨酸能使非甲基化的 DACT 1基因重新甲基化。
RT-PCR 結果提示 , 在未經 S- 腺苷 -L- 甲硫氨酸處理的 CNE 2 細胞中 DACT 1 高表達 , 而在經過 S- 腺苷 -L- 甲硫氨酸處理的 CNE 2 細胞中 DACT 1 不表達 , 這說明 S- 腺苷 -L- 甲硫氨酸通過改變 DACT 1 基因的甲基化狀態而改變了其表達。
transwell 小室實驗結果顯示 , 未經 S- 腺苷 -L- 甲硫氨酸處理的 CNE 2 細胞侵襲數 （χ2=13.50±2.15） 明顯多于經過 S-腺苷 -L- 甲硫氨酸處理的 CNE 2 細胞侵襲數 （χ2=8.50±1.08,t=5.868, P<0.001）。這說明 DACT 1 的表達情況影響 CNE 2 細胞的侵襲能力。
3討論
DACT 1 基因定位于 14q22.3, 其編碼 836 個氨基酸的蛋白質 , 氨基端有 1 個亮氨酸連接區域 , 羧基端有 1 個 PDZ 連接位點。最近研究發現 , 其是 1 個腫瘤相關基因 , 其可能通過增強 Bata- 連環蛋白的表達 , 影響 Wnt 信號轉導途徑 , 調節細胞周期及凋亡 , 進而調節腫瘤細胞的生長、增殖、侵襲及轉移。Yuan 等[1]研究發現 , DACT 1 在結腸癌細胞中的高表達能促進癌細胞的生長、增殖、遷移及侵襲能力。有研究認為[2], 在 B 細胞慢性淋巴細胞白血病細胞中 DACT 1 的高表達與其基因低甲基化有關。
DNA 甲基化是基因表觀遺傳學修飾的一種重要方式 , 即在 DNA 序列不變的情況下調節某些特定基因組區域的轉錄活性 , 控制該基因的表達[3].基因啟動子區 CpG 島甲基化狀態與基因的活性有關 , 啟動子區域 CpG 島高甲基化是基因失活的主要原因之一。先前研究發現 , 抑癌基因 DAPK 及腫瘤轉移相關基因 uPA 的表達與其基因啟動子區 CpG 島甲基化狀態有關 , 且這些基因的甲基化狀態是可逆的 , 可通過調節某些酶的活性改變這些基因的表達 , 進而影響鼻咽癌及喉癌細胞的生長及侵襲能力[4].本研究結果顯示未經 S- 腺苷 -L-甲硫氨酸處理的 CNE 2 細胞中 DACT 1 基因啟動子區非甲基化 , DACT 1 高表達 , 而經 S- 腺苷 -L- 甲硫氨酸處理的 CNE2 細胞中 DACT 1 基因啟動子區高甲基化 , DACT 1 不表達 ,且 CNE 細胞的侵襲能力明顯減弱。說明 S- 腺苷 -L- 甲硫氨酸在 DNA 復制過程中能使去甲基化的基因重新甲基化而失去表達 , 根據失活基因的功能而調節細胞的生長及侵襲 , 進而在腫瘤生長、侵襲及轉移中起重要作用。
綜上所述 , DACT 1 基因甲基化狀態與其表達有關 , 可以通過改變其甲基化狀態改變其表達 , 進而調控腫瘤細胞的生長及侵襲 , 進而調節腫瘤的進展。
參考文獻：
[1] Yuan G, Wang C, Ma C, et al. Oncogenic Function of DACT 1 inColon Cancer through the Regulation of b-catenin. Plos One, 2012,7（3）：1-17.
[2] Kong WJ, Zhang S, Guo CK, et al. Effect of methylation-associated silencing of the deathassociated protein kinase gene onnasopharyngeal carcinoma. Anti-Cancer Drugs, 2006, 17（3）：251-259.
[3] 張松 , 李爍 , 高春生 . uPA 基因啟動子區低甲基化在鼻咽癌侵襲轉移中的作用 . 腫瘤防治研究 , 2012, 39（6）：691-693.
[4] 葉星星 , 蔡志毅 , 陳佳玉 , 等 . 細胞周期素 G 在鼻咽癌細胞中的表達及其意義 . 中國衛生檢驗雜志 , 2010（11）：165-166.
