近年隨著科技的進步，越來越多的極度早產兒和極低出生體質量兒幸存下來，但是由于長期吸入高濃度氧，患兒可發生肺損傷，嚴重者甚至發生支氣管肺發育不良（ BPD）[1,2].目前，高氧性肺損傷的機制尚不清楚，最近研究的熱點主要集中在氧化應激方面[3,4],而 NAD+依賴性的組蛋白去乙?；福?SIRT1） 在氧化應激及 DNA 損傷修復中發揮重要作用[5].本研究在前期實驗基礎上，通過建立高氧損傷人肺泡上皮細胞（ HPAEC） 模型[6],探討 SIRT1轉位是否介導肺泡上皮細胞發生凋亡，從而為減輕高氧肺損傷尋找新的治療靶點。
1 材料與方法。
1. 1 細胞、儀器及試劑 HPAEC 細胞購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。LX71 型倒置相差顯微鏡購自 Olympus 公司，FORMA311 型 CO2培養箱、胎牛血 清、DMEM 高 糖 培 養 基 購 自 Gibco 公 司，ANNEXIN V流式細胞凋亡檢測試劑盒購自凱基生物公司，單克隆小鼠抗 SIRT1 抗體購自博士德生物公司，羅丹明標記山羊抗小鼠 IgG 購自 ZSGB-BIO公司，DAPI 購自碧云天生物公司，抗熒光淬滅封片液購自碧云天生物公司，單克隆小鼠抗 SENP1 抗體與單克隆抗乙?；?p53lys（ 382） 抗體購自 Abcam 公司，ECL 化學發光試劑購自北京普利萊基因技術有限公司。
l. 2 HPAEC 細胞培養 先將 HPAEC 細胞復蘇，加入含有 10% 胎牛血清的 DMEM 高糖培養液，放入37 ℃ 、含 5% CO2培養箱中培養。待細胞生長至對數生長期時，用 0. 25% 的胰蛋白酶進行消化，傳代培養。
1. 3 HPAEC 細胞分組及高氧干預 取對數生長期的細胞，消化后傳代接種于培養瓶中，隨機分為高氧組、對照組。對照組不作處理，放置于 50 mL/L CO2培養箱中培養； 高氧組換液 1 次后，以 3 L/min 的速度通入含 900 ml/L O2和 50 mL/L CO2高純混合氣，通入時間為10 min,參照我們前期高氧模型建立的方法[6].分別培養 24 h（ 高氧組細胞干預 24 h后，使用測氧儀檢測培養瓶中氧濃度，如果氧濃度 <90% 則棄去該標本） ,之后收集 HPAEC 細胞。
1. 4 HPAEC 細胞凋亡情況觀察 兩組細胞培養24 h后，收集細胞，用流式細胞儀檢測，按照凱基ANNEXIN V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作。
1. 5 HPAEC 細胞形態學觀察 倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態學變化，并照相。
1. 6 HPAEC 細胞 SIRT1 蛋白轉位情況觀察 將HPAEC 細胞消化后，按細胞密度為 2 × 104/ 孔接種于 6 孔板中蓋玻片上培養，同步化細胞，兩組均加入1 mL 培養基，高氧組另通入高濃度氧，分別培養24 h; 多聚甲醛固定細胞 10 min; 0. 3% Triton X-100打孔10 min; 5%封閉血清在37 ℃封閉30 min; 將稀釋的抗體 SIRT1（ 終濃度為 1∶ 100） 滴加在細胞爬片上，4 ℃冰箱孵育過夜，在避光情況下將羅丹明標記的山羊抗小鼠 IgG（ 終濃度為 1∶ 50） ,37 ℃濕盒中孵育 60 min; 用 PBS 洗滌 3 次，滴加 DAPI 復染，免疫共聚焦顯微鏡下觀察并照相； 每張細胞爬片截取 5個視野，每組 8 張爬片，并照相，計算細胞轉位率。
1. 7 HPAEC 細胞 SENP1、乙?；?p53 蛋白檢測采用 Western blotting 法。兩組細胞培養干預 24 h（ 細胞生長 80%融合） ,胰酶消化后 PBS 沖洗，離心并移 去 上 清。加 入 200 μL 裂 解 混 合 液，冰 浴30 min,離心取上清，電泳、轉膜，加入一抗，再加入顯色的二抗，以 TBST 清洗，使用 ECL 進行結果的顯影，然后用 Labworks4. 6 分析目的條帶的灰度值。
1. 8 統計學方法 采用 SPSS17. 0 統計軟件。計量資料以x ± s 表示，組間比較采用 t 檢驗； 計數資料比較采用 χ2檢驗。P <0. 05 為差異有統計學意義。
2 結果。
高氧組和對照組細胞凋亡率分別為 24. 77% ±2. 17% 、5. 33% ± 2. 60% ,兩組比較，P < 0. 05.高氧組細胞從正常的長梭形、多角形變成圓形、橢圓形，細胞間的間隙增寬，懸浮的細胞較多； 對照組細胞大多為長梭形、多角形，貼壁較好，細胞間的間隙較小，懸浮的細胞較少。高氧組和對照組細胞 SIRT1 蛋白轉位率分別為 88. 89% （ 96/108） 、16. 23% （ 25/154） ,兩組比較，P < 0. 05.高氧組和對照組細胞SENP1 蛋白相對表達量分別為 0. 76 ± 0. 12、0. 67 ±0. 02,乙?；?p53 蛋白相對表達量分別為 0. 81 ±0. 07、0. 52 ± 0. 03,兩組比較，P 均 < 0. 05.
3 討論。
近年來，早產兒的出生率逐年增高，早產兒中大部分會發生夭折，氧療是提高早產兒存活率的有效方法，但是長時間高濃度吸氧可導致肺損傷，從而導致 BPD 的發生[7].活性氧簇（ ROS） 增多所致的氧化應激損傷是早產兒高氧肺損傷發生的主要機制[8],而 SIRT1 蛋白能顯著降低 ROS 水平和促進細胞生存[9].
SIRT1 蛋白是一種 NAD+依賴性脫乙酰酶，作為哺乳動物生命周期相關蛋白，其主要功能是調節細胞氧化應激反應和調控生命周期。SIRT1 蛋白主要定位于細胞核，在細胞能量代謝、DNA 損傷修復、細胞周期控制、抑制細胞凋亡、抗氧化逆境和延長細胞壽命方面發揮重要的調控作用，是機體內抗氧化應激的關鍵蛋白[10,11].Yang 等[12]用紫外線輻射、過氧化氫誘導人肺腺癌細胞后發現，SIRT1 蛋白可發生翻譯后修飾，在 734 位賴氨酸上發生小泛素樣修飾蛋白（ SUMO） 修飾。該修飾決定著 SIRT1 蛋白在細胞核的定位。這是一個動態的、可逆的過程，其去 SUMO 修飾的過程則由 SENP1 介導[13,14].SIRT1蛋白主要存在于細胞核，少量存在于細胞質，當細胞應激時 SIRT1 蛋白能被 SENP1 去 SUMO 化，使 p53蛋白的第 382 位賴氨酸殘基去乙?；瘻p少，抑制p53 與靶 DNA 順式原件結合，進而抑制 p53 促凋亡活性[15 ~18].本研究顯示，高氧組細胞生長較差，細胞間隙增寬，懸浮細胞較多，細胞的凋亡率增加，這與我們的前期實驗[6]結果一致，即高氧可以誘導細胞凋亡。本研究還顯示，高氧組 SENP1 蛋白表達、SIRT1 轉位率、乙?；?p53 表達均較對照組升高，這與 Yang 等[12]結果一致。提示高氧可誘導細胞凋亡，其凋亡的機制與 SIRT1 蛋白相關。
總之，高氧誘導 SENP1 蛋白表達，促使 SIRT1蛋白發生去 SUMO 化，發生核質轉位，去乙?；钚詼p低，對 p53 去乙?；钚詼p低，乙?；?p53 相對增加，從而激活下游的凋亡通路而介導細胞凋亡。
參考文獻：
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[2]Jin L,Yang H,Fu J,et al. Association between oxidative DNAdamage and the expression of 8-oxoguanine DNA glycosylase 1 inlung epithelial cells of neonatal rats exposed to hyperoxia[J]. MolMed Rep,2015,11（ 6） : 4079-4086.
[3]Schumacker PT. Lung cell hypoxia: role of mitochondrial reactiveoxygen species signaling in triggering res-ponses[J]. Proc AmThorac Soc,2011,8（ 6） : 477-484.
