誘導多潛能干細胞 （induced pluripotent stemcells,i PSCs） 是通過在分化的體細胞中表達特定轉錄因子，以誘導體細胞重編程而獲得的可不斷自我更新且具有多向分化潛能的細胞。i PSCs在功能上類似于胚胎干細胞（embryonic stem cells,ESCs） ,增殖分化能力強，既能避免免疫排斥，又不涉及倫理道德問題，而且取材方便，具有重要潛在臨床應用價值[1].因此，自開始培養出i PSCs[2,3]以來，全世界眾多實驗室都對i PSCs進行了研究并取得了很大進展。
但將i PSCs用于腦內移植治療卒中動物模型后發現，i PSCs極易形成腫瘤，也難以確定有無成熟神經元形成[4 ~ 6],對模型動物行為學改善也報道不一[4 ~ 6]; 即使將i PSCs植入正常小鼠腦內也一樣具有成瘤性[7].
由于i PSCs在形態及生物學功能上類似ESCs而會在移植后形成畸胎瘤[8],故許多人認為如果移植前將ESCs在體外預先分化就可以減少腫瘤形成的危險性[9].這可以先將ESCs誘導成神經前體細胞（neural precursor cells,NPCs） ,再把ESCs來源的NPCs植入腦內。研究發現，這種NPCs不但可以存活，而且能向神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞分化，甚至有的細胞具備成熟神經元的電學特性，重要的是沒有出現腫瘤[10 ~ 12].目前報道的將ESCs誘導成NPCs的方法有多種，但一般都難以重復。為此，本實驗采用經擬胚體（embryoid bodies,EBs）以及N2B27為選擇培養基，多步法貼壁培養誘導NPCs,為國內從事本領域研究的同道提供借鑒，也為下一步細胞移植治療缺血性腦損傷做準備。
材料和方法
1.小鼠i PSCs的培養
本實驗i PSCs由中國科學院動物研究所提供，培養方法參照文獻[13].
2. i PSCs向NPCs的誘導
吸去ESCs培養液，PBS洗3次后用0. 05%的胰蛋白酶消化2min,ESCs培養液中和，玻璃吸管吹打，1000r/min離 心5min,去 上 清。添 加 新 鮮 的ESCs培養液，玻璃吸管吹打成單細胞懸液，接種到0. 1%明膠包被 的瓶 內，37℃ 、5% CO2孵 育30 ~60min,去 除 胎 鼠 成 纖 維 細 胞 （mouse embryofibroblast,MEF）。吸取細胞懸液，1000r / min離心5min,吸去上清，添加N2B27培養基重懸細胞，接種在無任何包被的瓶內，入37℃、5% CO2孵箱培養，次日觀察EBs的形成。EBs培養4 ~ 7d,每天換液。離心收集EBs,用N2B27培養基將其重懸，接種在0. 5%明膠包被的塑料培養瓶內貼壁培養，隔天換液。10d后EBs爬出神經干細胞樣細胞，0. 05%胰蛋白酶消化，接種在0. 1%明膠包被的6孔板上，用NPCs培養基培養，每天換液，2 ~ 3d傳代。
N2B27培養基200ml包括DMEM / F-12 99ml,N-2Supplement 1ml,2%牛血清清蛋白（BSA）250μl,Neurobasal 98ml,B-27Supplement 2ml,10g / L胰島素200μl,200mmol / L谷氨酰胺2ml,10mmol / L β-巰基乙醇2ml,105IU / L青鏈霉素200μl.
3. NPCs的培養
待細胞長滿接近95%左右匯合時，吸去培養液，0. 05%胰蛋白酶消化2min,立即用MEF培養基終止消化，吹打，離心。去上清，用NPCs培養基重懸細 胞，接 種 在0. 1%的 明 膠 預 先 包 被 （37℃，30min） 的孔板（ 或培養瓶） 內，37℃ 、5% CO2孵箱培養?；蛉ド锨搴?，加適量的NPCs凍存液，放入梯度凍存盒- 80℃過夜，次日入液氮。
NPCs培養基200ml是在200ml N2B27培養基的基礎上添加0. 1g /L的堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor,b FGF）40μl和0. 1g /L表皮生長因子（EGF）40μl.
4. NPCs的分化
將NPCs在原有NPCs培養基的基礎上去掉Neurobasal、B-27Supplement,進行培養傳代，7d后光學顯微鏡下觀察細胞形態的改變，進行免疫熒光染色。
5. NPCs的鑒定
采用免疫熒光染色進行鑒定。將NPCs與在分化培養基內培養的NPCs分別傳代到0. 01%多聚賴氨酸包被的放有小圓片的24孔板內，過夜，細胞貼壁。次日，棄去培養基，PBS快速洗1次。4%的多聚甲醛固定30min,PBS洗3次，每次5min.0. 3%PBST打孔，室溫孵育30min.10%正常山羊血清封閉1h（ 用0. 3% PBST稀釋）。一抗小鼠抗巢蛋白（Nestin,1∶ 1000,Abcam公司） 抗體、兔抗β-微管蛋白Ⅲ（β-tubulinⅢ，β-Tub-Ⅲ，1∶ 800,Sigma公司） 抗體孵育，4℃冰箱過夜（ 用封閉液稀釋一抗） ,PBS洗3次，每次5min.二抗（Alexa Fluor 594山羊抗小鼠Ig G,Alexa Fluor 488山羊抗兔Ig G,用封閉液1∶ 500稀釋，Invitrogen公司） 室溫避光孵育1h,PBS洗3次，每次5min.Horchest33258（1 ∶ 3000 PBS稀釋，Sigma公司） 復染細胞核10min,PBS洗3次，每次5min.70%的甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。對照組用PBS代替一抗。
結 果
1. i PSCs的培養
i PSCs在飼養層細胞上克隆性成團生長。每個i PSCs克隆大小基本一致，呈近似圓形、橢圓形或梨形均勻分布在交錯呈網的MEF上，整個克隆形態飽滿，透光性好（ 圖1）。
