骨代謝的平衡由骨形成和骨吸收維持，成骨細胞（OB） 和破骨細胞（OC） 起著重要作用。其中，OC是一種具有獨特骨吸收功能的多核巨細胞，來源于造血細胞系，屬于終末細胞，不能增殖和傳代〔1〕。而破骨樣細胞（OLC） 是指具有OC性質，通過原代培養或實驗誘導生成的，用于實驗研究的細胞。到目前為止，還沒有成熟的OC株。自從Testa等〔2〕首次在體外培養骨髓造血細胞時發現能夠形成OC后，骨髓誘導培養法分化OLC的技術形成并逐漸開展應用。獲得OC的方法多種多樣，包括誘導培養、直接培養等技術都逐漸趨于穩定成熟，有助于著手從基因水平深入研究骨吸收的機制，從而進一步開發代謝性骨病的治療藥物。本文擬證實慢病毒轉染OLC的可行性，為進一步利用OLC進行基因學研究奠定重要基礎。
1 材料與方法
1. 1實驗動物4周齡雌性SD大鼠，購自吳氏實驗動物中心。
1. 2主要試劑、材料和儀器 低糖DMEM培養基 （ 美國Hy-clone公司） ,中美胎牛血清（Bioind） ,紅細胞裂解液，雙抗、磷酸鹽緩沖液 （PBS,美國Gibco公司） ,鼠M-CSF、RANKL（ 美 國Peprotech公司） ,抗酯酸性蛋白酶染色試劑盒（TRAP,美國Sig-ma公司） ,NFAT抑制劑 （ 德國Calbiochem公司 ） ,Trizol（ 美國Ambion公司） ,逆轉錄試劑盒（Ta KaRa） ,SYBR Green試劑（In-vitrogen） ,NFAT2RNAi慢病毒、對照病毒由廈門欣基公司包裝合成，引物由上海生工公司合成；10 cm培養皿、六孔板（ 美國Corning公司） ;CO2培養箱（ 美國Thermo公司） ,DM2500熒光顯微鏡（ 德國Leica公司） ,PCR擴增儀（ 美國Bio-Rad公司） ,熒光定量PCR儀7500型（ 美國ABI公司）。
1. 3大鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs） 的分離與誘導培養 取SD大鼠麻醉后處死，無菌條件下取雙側股骨和脛骨，剔除多余軟組織，用5 ml注射器吸取適量低糖DMEM沖洗骨髓腔，直至骨髓腔 變 白，取 沖 洗 液 充 分 吹 打 制 成 細 胞 懸 液 后 離 心，800 r / min,3 min.棄上清加紅細胞裂解液，混勻靜置2 min,800 r / min離心3 min,棄上清去除紅細胞，得到白細胞沉淀。重懸于含25. 0 ng/ml M-CSF +50. 0 ng/ml RANKL的低糖DMEM完全培養液（ 含10% FBS、1%青霉素與鏈霉素） ,接種于10 cm培養皿，37℃ 、5% CO2、飽和濕度培養箱中培養24 h.取未貼壁細胞，調整細胞密度為2. 5×105重懸于含25. 0 ng/ml M-CSF +50. 0 ng / ml RANKL（ 大鼠） 的低糖DMEM完全培養液，接種于六孔培養板，繼續培養，首次半定量換液，以后每隔3 d換液。
1. 4慢病毒轉染OLC并分組 以hela細胞（2. 5 ×104/孔） 對比，待獲得的OLC生長融合達約60%時，對照病毒（ 無NFAT2沉默） 轉染按感染復數（MOI）15、5、1各分為三組，18 h后首次換液，此后每2 ~ 3 d換液1次并于第5天觀察熒光表達情況，熒光顯微鏡（×200） 下隨機選取5個視野拍攝OLC和hela細胞，并用Image-Pro Plus專業圖像分析軟件計數。
1. 5 TRAP染色及計數 將OLC于轉染后第5天棄培養基，PBS沖洗2遍，檸檬酸鹽/丙酮固定液室溫下固定30 s,用蒸餾水沖洗、晾干，按試劑盒說明書行TRAP染色，倒置相差顯微鏡（×200） 下隨機選取5個視野計數3個核以上破骨細胞，并在200倍光鏡下，用Image-Pro Plus專業圖像分析軟件計數。
1. 6 NFAT2抑制劑干預OLC將獲得的OLC融合率達到60%左右時，進行不同干預并分為OLC對照組、NFAT2抑制劑（VIVIT） 組、NFAT2iRNA慢病毒組、對照病毒組。NFAT2iRNA慢病毒組和對照病毒組病毒劑量均以MOI = 15為參數，VIVIT試劑以2 μmol/L每孔連續干預3 d,此后每2 ~ 3 d換液1次并于第5天進行RT-PCR檢測。
1. 7 RT-PCR檢測 細胞總RNA用Trizol提取。取總RNA2 μg,按反轉錄試劑盒 （Ta KaRa） 步驟完成反轉錄。以GAPDH為內參照，取2 μl反轉錄產物分別以下述引物進行PCR擴增。引物序列及反應條件：①NFAT2: 順向GGAGGGAAGAAGATG-GTGTTGT,反向CTGGTTATTCTCTGGTTGCGG;② GAPDH: 順向AGTGCCAGCCTCGTCTCATAG,反向CGTTGAACTTGCCGTGGG-TAG; 反應條件：95℃ 30 s后，95℃ 5 s,60℃ 34 s,反復循環40次，95℃ 15 s,60℃ 1 min,95℃ 15 s后結束反應。采用2-ΔCt的方法計算基因相對表達量，公式： 目的基因表達量= 2-ΔCt,ΔCt =Ct目的基因-Ct內參基因。
1. 8統計學方法 應用SPSS13. 0軟件選用單因素方差分析（One-way ANOVA）、LSD方法統計。
2 結 果
2. 1細胞生長特性 倒置顯微鏡下觀察，大鼠BMSCs培養24 h后開始貼壁，呈梭形，誘導后細胞逐漸變大，集落融合成多核破骨細胞，第9天時細胞狀態最佳，數量最多，隨后細胞開始皺縮，出現大量空泡。MOI = 15、5、1均未見明顯的細胞毒性。見圖1.
2. 2轉染及計數 帶有綠色熒光蛋白（GFP） 標記的對照病毒轉染OLC后第5天在倒置熒光顯微鏡下觀察，可見轉染上的OLC發出較強的綠色熒光，胞體大、形態不一、核數≥3、細胞外圍有一明顯皺褶緣。隨著MOI值的升高，hela的轉染數增加，各組之間比較均有顯著差異（P<0. 01）。OLC組在MOI = 15時，轉染數最多，與MOI = 5、1比較有統計學差異（P<0. 01）。MOI = 15時，OLC褶皺緣明顯、熒光強；MOI = 5、1時，轉染的OLC熒光較弱，皺褶緣少，其他細胞轉染較多。見圖2,表1.
2. 3 TRAP染色及數量 誘導的OLC經TRAP染色后胞質深染呈紫紅色，而胞核陰性，核數目≥3,多位于周邊。經Image-Pro Plus計數分析后，MOI = 15組 （53. 60 ± 3. 65）、MOI = 5組（47. 20±3. 83）、MOI= 1組（48. 80±7. 12） 細胞數量均無顯著差異（P>0. 05）。見圖3.
2. 4 NFAT2iRNA慢病毒轉染OLC后NFAT2的表達 不同病毒轉染OLC后 熒 光 顯 微 鏡 下 觀 察，與 對 照 病 毒 組 比 較，NFAT2iRNA慢病毒組OLC數目少，熒光強度弱，未見皺褶緣。經過不 同 干 預 后，NFAT2抑 制 劑 組 （0. 009 7 ± 0. 001 7） 和NFAT2iRNA慢病毒組（0. 009 6 ± 0. 002 0） 的NFAT2基因表達明顯 低 于OLC對 照 組 （0. 015 8 ± 0. 002 6） 和 對 照 病 毒 組（0. 015 9±0. 002 5） （P<0. 05）。而OLC對照組和對照病毒組、NFAT2抑制劑組和NFAT2iRNA慢病毒組之間的NFAT2基因表達無顯著差異（P>0. 05）。見圖4.
3 討 論
骨代謝疾病如骨質疏松、Paget病、牙周炎等病理變化都存在骨吸收異常，其中OC起重要作用〔3〕。OC在體外很脆弱，培養難度高，純度不高。本實驗將大鼠BMSC在體外培養過程中加25. 0 ng/ml M-CSF +50. 0 ng/ml RANKL進行誘導，獲得一定量的成熟OLC,觀察培養至第9天時數量最多，與其他培養方法比較，與體內OC生物學功能最接近〔4〕，最適合用于體外深入研究。
慢病毒載體是以人類免疫缺陷I型病毒（HIV-1） 為基礎發展起來的基因治療載體，可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久穩定的表達。在感染能力方面不同于腺病毒和逆轉錄病毒，可有效地感染一些較難轉染的細胞，如原代細胞、干細胞、不分化細胞等，適用于OC的體外研究〔5〕。GFP是一種新型報告基因，與目的基因構成融合基因后，通過載體（ 如質粒、慢病毒、腺病毒） 轉染，細胞可表達GFP蛋白，產生綠色熒光。本實驗發現慢病毒轉染效果與MOI值有密切關系，隨MOI值的增加而升高，TRAP染色進一步驗證MOI = 15、5、1對細胞均無較明顯毒性作用。
Ca2+/ NFATc1信號通路是OC內重要的信號系統，參與調節OC的分化和成熟〔6〕?；罨疶細胞核因子家族中的NFATc1已被證實是其中重要的轉錄調節因子，參與許多OC特異性基因的表達調控，對OC分化和骨吸收功能至關重要〔7〕。有研究表明，NFATc1基因敲除的小鼠表現為骨硬化癥〔8〕； 其基因缺陷的胚胎干細胞不能分化成OC,但表達外源性NFATc1的前體細胞在沒有RANKL的情況下也能向OC分化〔9〕。因此，可選擇最適宜的MOI值用NFAT2iRNA慢病毒對OC進行基因驗證。NFAT2iRNA慢病毒進入OC轉染成功后使NFAT2基因沉默，表達下降，而對照病毒沒有使NFAT2沉默的作用，同時加入VIVIT作為對照，VIVIT組和NFAT2iRNA慢病毒組的NFAT2基因表達明顯低于OLC對照和對照病毒組，說明轉染成功。此外，熒光顯微鏡也進一步證明NFAT2對OC的分化和成熟的重要性。
體外成功轉染OC的主要措施： 保證轉染前細胞活性處于最佳狀態； 病毒轉染前更換新培養基效果最好； 加病毒后一般需在8 ~ 12 h更換培養基。經過反復大量實驗，發現對于OC18個小時為最佳換液時間； 采用1 ~ 2個月大鼠，所誘導的OC最多； 動物從處死到分離細胞速度要快，OC不易受損； 嚴格無菌操作，誘導因子足量； 采用差速貼壁法純化OC,因所分離成纖維細胞等貼壁速度快，在培養24 h后收集未貼壁細胞接種至另一培養板中可提高純度； 純化后OC為更好貼壁，2 ~ 3 d內需要靜置培養，不宜挪動。
綜上所述，此次OC轉染成功為今后骨代謝疾病的基因治療開拓了廣闊的道路，利用攜帶目的基因慢病毒載體轉染OLC,研究骨吸收的具體分子機制及有關OC內分化的信號通路是今后進一步實驗的方向。
4 參考文獻
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