血 管 平 滑 肌 細 胞（vascular smooth musclecells,VSMCs）是動脈發生鈣化的主要細胞，最近研究發現血管鈣化類似于骨的形成，它是由細胞介導的主動調節過程，同時存在平滑肌細胞表型轉變，并與多個成骨相關類因子相關[1].以往體外研究動脈病變的平滑肌細胞主要來自動物或人的主動脈[2],而對外周動脈的研究很少。血管平滑肌細胞是血管中膜的主要細胞成份，它的鈣化與血管的許多生物學行為有關。既往報道[3],VSMCs體外培養后傳代，其生物學特性仍然接近體內細胞，以體外培養VSMCs為基礎。模擬各種體內外干預條件，觀察研究VSMCs的細胞及分子生物學特性的改變，是研究心血管疾病發病機制的良好手段。本研究以酶消化法為基礎，總結一種方便、快捷、重復性高的分離、培養方法并進一步建立體外平滑肌細胞鈣化誘導模型，為外周動脈病變體外研究奠定基礎。
1 材料與方法
1.1材料
DMEM培 養基（Hyclone公 司）、胎牛 血 清（Hyclone公 司）、DAPI染 液（Sigma公 司）、DMSO,0.25%胰蛋白酶（上海碧云天公司）、一抗：α-SMA單克隆抗體（Bioworld公司）、二抗：羊抗兔FITC標記二抗（武漢博士德公司）、山羊封閉血清（北京博奧森公司）。
1.2人股動脈VSMCs的體外培養
1.2.1人股動脈分離及原代培養
取正常人股動脈，由中山大學附屬醫院血管外科王冕博士提供，取自于正常遺體捐獻者。無菌環境下手術刀片刮除外膜和內膜，將中膜平滑肌層分別剪成1~2mm大小的組織塊，鑷子逐個貼在25cm2培養瓶上，培養瓶緩慢翻轉，加入20%的胎牛 血清含100U/L的青 鏈霉素的DMEM培 養 液10ml,孵育在37℃，5%的CO2的培養箱中；2h后輕輕翻轉培養瓶，組織塊被充分覆蓋。培養箱中孵育，2周左右觀察平滑肌細胞生長情況。
1.2.2人股動脈平滑肌細胞的傳代培養
將相互融合的原代培養的人股動脈VSMCs,在換液后的d3,棄去原培養液，用無菌的PBS輕輕沖洗3遍，用胰酶消化1min后，隨即加入新鮮含10%胎牛血清的DMEM培養液終止消化，用吸管反復吹打培養瓶100次，注意用力不能太大，否則細胞破碎。使細胞完全脫離瓶壁，鏡下計數：調整密度為1.0×105/ ml的細胞懸液，吸取5ml傳入新的培養瓶中，每3d換液1次，每次換液量約4ml,待細胞長至融合狀態后，可再傳代。
1.3人股動脈平滑肌細胞的鑒定
1.3.1細胞形態學觀察
將培養的平滑肌細胞置于倒置顯微鏡下，觀察細胞貼壁、生長狀況及形態并照相。
1.3.2免疫熒光染色
（1）將平滑肌細胞接種在13mm直 徑圓形載長約40%~50%左右，吸取培養基，加PBS沖洗3次，每次5min左右；（2）加入4%的多聚甲醛4℃條件下固定15min,加入PBS沖洗5min×3次，之后用預冷CH3OH洗3次；（3）預冷CH3OH -20℃通透平滑肌細胞5min,PBS再次沖洗5min×3次；（4）用10%的 山羊血清5%BSA封 閉液室溫封閉20min,加入1:150小鼠抗人平滑肌α-actin單克隆一抗，4℃孵育過夜，次日室溫復溫1h;（5）加入PBS清洗5min×3次，滴加綠色熒光標記的羊抗小鼠二抗，室溫避光孵育1h,PBS清洗5min×3次；（6）DAPI染 液 染細胞核15min,dd H2O清 洗； （7）Mounting Medium封片，熒光顯微鏡拍照，4℃避光保存。
1.4凍存細胞
選融合度>90%的細胞；按傳代方法用EDTA把貼壁生長的細胞消化下來，反復吹打100次；1000rpm離心去上清，吸入離心管中。先用DMEM高糖培養基8份+1份胎牛血清+1份二甲基亞砜配成10%的細胞凍存液，混勻后吸管吸至10ml離心管中，然后吹打細胞，動作輕柔，使細胞充分混勻。分裝至1.5ml凍存管中。將細胞凍存管放入4℃冰箱30min,后置入-20℃冰箱2h后，直接放入-80℃冰柜中。
1.5鈣化模型的建立
用鈣化培養基（正常對照組的DMEM培養基中 加 入10mmol / L β磷 酸 甘 油，10mmol / L丙 酮酸）培養，2d換液1次，連續培養10d,以制備鈣化的VSMCs.
1.6統計學方法
應用SPSS 13.0統計軟件分析，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。
2 結果
2.1原代平滑肌細胞培養（圖1,見插二）
組織塊貼壁后1周，在倒置顯微鏡下觀察，發現有細胞從垂直方向從組織塊邊緣遷移萌出（圖1A）；2周 左右當組織塊中大部分細胞萌出后，組織塊便脫離，其周圍細胞密度更加增大，部分區域細胞相互接觸交替生長，出現“峰-谷”結構（圖1B）。平滑肌細胞從組織塊的周圍爬出，隨著時間的推移，4周時，平滑肌細胞呈典型的“峰谷狀”生長（峰：即多層細胞丘，可達8~10層，谷：即稀疏排列的單層細胞處，甚至無細胞處）（圖1C）。
隨著傳代次數的增多，平滑肌細胞生長周期逐漸縮短，五代以后維持在3~5d左右，八代以后維持在1~2d左右，所以我們選用3~8代的細胞作為本實驗的細胞。
2.2平滑肌細胞的鑒定
如圖2（見封三）示，經過免疫熒光發現，細胞SMα-actin高表達，說明成功培養出平滑肌細胞。
2.3平滑肌細胞鈣化模型的建立及鑒定
2.3.1鈣化斑塊的形成（圖3,見封三）
正常培養見圖3上，鈣化培養見圖3下。在普通培養基下，幾乎不可見鈣化斑塊形成（白色光點為鈣化斑塊）；而在鈣培養條件下，可見平滑肌細胞出現明顯的鈣化斑塊。
2.3.2 VON KOSSA染色（圖4,見封三）
正常對照見圖4上，鈣化培養見圖4下。在普通培養基下，幾乎看不到鈣化斑塊形成（細胞VON KOSSA染 色，核固紅復染后若為鈣沉積則細胞質，細胞核均呈現紅色或者淡粉色）；在鈣化培養條件下，可見平滑肌細胞出現明顯鈣化斑塊。
2.3.3 VON KOSSA后光密度值比較
通過軟件分析鈣化斑塊的累積光密度值，發現鈣化組鈣鹽沉積量顯著高于對照組（0.24 vs.0.04,P<0.01）。
3 討論
血管平滑肌細胞（VSMCs）是血管發生鈣化的主要細胞，它的異常增殖是高血壓、冠狀動脈粥樣硬化和冠狀動脈介入治療（PCI）術后再狹窄（RS）等疾病的主要病理生理機制[4].對 于高鈣導致血管鈣化的機制尚未明確，目前采用的措施及方法比較局限[5].既往的研究只局限于動物和主動脈，和外周動脈存在很大的生物學差異，不能反映人體外周血管病變的細胞學特點。所以我們選用成人股動脈平滑肌細胞來作為研究的對象。目前眾多實驗室仍采用培養豬、兔、鼠等動物血管平滑肌細胞來研究平滑肌細胞的表達，但動物與人比較，有很大生物學特性的差異，亦有研究者采用胸主動脈、腸系膜動脈、人臍動脈來進行體外試驗，但是取材困難，亦不能代表外周血管平滑肌細胞所具有的特點。所以本實驗選擇采用更接近于外周血管特點的人股動脈，通過改良的方法，使用組織塊貼壁法來建立人股動脈平滑肌細胞體外培養模型，為完成相關的實驗打好堅實的基礎。
通過組織塊貼壁后3周，在倒置顯微鏡下觀察，發現有平滑肌細胞從組織塊周圍爬出，隨著時間的推移，5周時平滑肌細胞呈典型的“峰-谷”生長，隨著傳代次數的增多，平滑肌細胞生長周期逐漸縮短，五代以后維持在3~5d,八代以后維持在1~2d,所以我們選用3~8代的細胞作為本實驗的細胞。通過免疫熒光發現，細胞SMα-actin高表達，說明成功培養出平滑肌細胞。
VSMCs體外誘導鈣化是研究心血管疾病發病機制的重要細胞模型。 Giachelli首先證實了人VSMCs在高鈣、高磷培養基中生長可發生鈣化[5].β-磷酸甘油是堿性磷酸酶的作用底物，分解后可以產生磷酸鹽，供給體外鈣化所必需的磷離子，從而促進細胞鈣沉積[6,7].而平滑肌細胞的鈣化是導致ASO發病和外科干預再狹窄的主要原因[8,9].我們研究發現平滑肌細胞經鈣化培養10d后，鈣化組與正常組別相比，在普通培養基下，幾乎無鈣化斑塊形成（白色光點為鈣化斑塊）；而在鈣培養條件下，可見平滑肌細胞內出現明顯的鈣化斑塊及鈣鹽沉積。通過平滑肌細胞VON KOSSA染色結果表明對照組細胞質、細胞核均未呈現紅色，而鈣化組細胞質、細胞核呈現粉紅色。累計光密度值分析后發現，鈣化培養10d后，細胞內鈣鹽沉積量顯著高于對照組。
本研究證實了人股動脈平滑肌細胞處于高鈣環境下鈣化的表達，這與體內血管鈣化形式非常接近，可作為研究外周血管鈣化的細胞模型。
4 參考文獻
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