不能產生動作電位的非可興奮細胞（ 血液細胞、上皮細胞、結締組織、骨骼、腫瘤細胞等） 接受寬頻電場作用后，細胞可產生極化的被動響應，即頻域細胞被動電特性（passive electrical propertiesof cells）。細胞電阻抗、膜電容、電導率、電阻率、介電常數等均為頻域細胞電生理學參數。

利用快響應、低成本、高敏感的電阻抗技術，檢測細胞阻抗譜可對癌細胞進行鑒別，并已應用于乳腺癌細胞的鑒別[1],膀胱癌的診斷分析[2],白血病K562癌細胞的鑒別[3]等。電阻抗技術作為一種非侵入式和無標記的技術，在黃斑變性定量分析[4]、G蛋白偶聯受體的研究[5]和細胞周期檢測[6]等方面也得到了應用。

NCM460細胞是人正常結腸細胞，通常作為結腸癌的對照組細胞。因其易于培養，轉染效率高的特 點，以 往 主 要 集 中 在 細 胞 的 增 殖 與 凋亡[7],浸潤與轉移[8]等方面的研究，缺少電學特性的研究報道。本文采用細胞體外培養和交流電阻抗技術，測量NCM460細胞電阻抗譜，建立正常細胞的電生理指標，目的是為進一步研究結直腸癌細胞（COLO 205,SW48,Lo Vo等） 的電生理變化奠定基礎。

2 方法

2. 1細胞培養

NCM460細胞購自INCELL公司，使用RPMI-1640（GIBCO公司） 培養基進行培養。培養基含10%小牛血清 （Hyclone公司） ,1% 100 U / m L青霉素和鏈霉素（GIBCO公司）。細胞培養環境設置為溫度37 ℃，5% CO2,濕度100% .細胞經過培養傳代后，無菌條件下經胰酶消化收集至15m L離心管中，25 ℃，1000 r / min離心10 min,得到高濃度富集細胞懸液。

2. 2測量池

由透明有機玻璃圓管兩側嵌入兩平行鉑片制成，電極圓盤直徑d = 3. 2 mm,電極間距L = 9. 4mm,容積約73. 29 μL.測量在（25 ± 1）℃進行。

2. 3阻抗測量

電阻抗譜測量由計算機控制的精密阻抗分析儀（Agilent 4294A） 完成。在40 Hz ~ 110 MHz頻率范圍內選取201個點，每個頻率點設定自動循環掃描測量3次。每個細胞樣本的測量在1 min之內完成。交流激勵信號源電壓100 m V,測量幅值| Z|和相位角θ，復數阻抗Z*= | Z | e- jθ= Re Z -j Im Z,復阻抗實部Re Z = | Z | cosθ，復阻抗虛部Im Z= | Z | sinθ，這里j槡= √- 1,ω = 2πf,f為激勵信號頻率。測量過程中對細胞懸浮液施加的電壓100m V,不會對細胞狀態造成影響。

2. 4細胞容積比值

采用毛細比容管離心方法，把細胞懸浮液注入其中，用Haematokrit 210微量血液離心機以9000 r / min離心10 min,細胞容積比值=（l / L）× 100%,其中l為細胞的長度，L為細胞與上清液的總長度。

3 結果與討論

3. 1細胞容積比值對幅頻曲線和相頻曲線的影響

圖1顯示NCM460細胞電阻抗幅值（| Z |）、頻率（f） 和細胞容積比值（CVR） 的三維立體圖。在| Z|與f的平面，構成了幅頻曲線： 隨頻率增加，阻抗幅值由低頻阻抗幅值（ZL） 逐漸減小至高頻阻抗幅值（Zh） ,表現出較大的弛豫過程，此過程與其他細胞相似，如血液[9-10]、肝癌細胞[11]和肺鱗癌細胞[12].其原因是在較低頻率電場作用細胞時，誘導出細胞極化，即細胞膜電容呈開路，阻抗較大，電流在低阻抗的細胞外區域流動； 隨電場頻率的增加，細胞的極化狀況逐步減??； 當較高頻率電場作用細胞時，細胞極化狀況極低，細胞膜呈現短路，阻抗（ZC= 1 / jωC） 較小，電流極易流過細胞內，故表現出低頻高阻抗，高頻低阻抗的弛豫過程[11].

細胞屬于非均勻電介質，電場致細胞極化，產生電位移，相位角θ就是電位移與電場強度之間存在位相差。低頻交流電場作用于細胞懸浮液時，電流選擇電阻抗較小的細胞外液區域流動，繞過細胞，表現為相位角接近于零的細胞電特性； 當交流電場作用細胞膜時，相位角出現峰值θp,它反映了細胞膜電容性弛豫性的變化過程，表明細胞膜對 交 流 電 場 的 響 應 特 性，稱 為 特 征 頻 率（characteristic frequency,fc）。

圖2所示NCM460細胞的相位角（θ）、頻率（f） 和細胞容積比值（CVR） 的三維立體圖。在θ與f的平面，構成了相-頻曲線，隨頻率增加，相位角表現出不同特征： 在f = 102~ 104Hz范圍，θ值接近零； 在f = 104~ 107Hz范圍，θ值出現明顯的山峰型弛豫，其峰值頻率是中心特征頻率fc,峰頂 點到橫坐標的落差是相位角峰值θp（ 圖2左上圖） ; 在f = 107~ 108Hz范圍，θ值上揚。

3. 2細胞容積比值對復阻抗平面圖的影響

圖3表示不同比容NCM460細胞的Nyquist圖，又稱復電阻抗平面圖。此圖呈現由低頻到中頻的半圓弧軌 跡 和 高 頻 的 翹 尾 現 象。復 阻 抗（Z*） 由實部（Re Z） 和虛部（Im Z） 組成： 實部系電阻，虛部系電容阻抗。在10 k Hz ~ 7 MHz范圍，細胞膜極化效應引起電容性變化的β散射，即Max-well-Wagner效應[13],在圖3表現成半圓弧特征；當電場頻率f = 7 MHz ~ 100 MHz時，細胞膜短路，電感成分引出圖3的翹尾現象。右截距是低頻阻抗實部（Re ZL） ,圓弧頂點到橫軸距離是阻抗虛部峰值（Im Zp） ,圓弧峰值對應的頻率稱為中心特征頻率fc,fc與細胞容積比值呈線性關系，其線性方程為：fc= 0. 71 - 0. 0024CVR.其一元線性回歸方程的斜率K = - 0. 0024極低，即回歸直線近乎與橫坐標軸平行，這說明特征頻率與細胞容積比值的變化無關（ 圖3）。

NCM460細胞的fc=（0. 64 ± 0. 04）MHz,與乳腺癌細胞（MCF-10A的fc= 0. 16 MHz,MCF-7的fc= 0. 31 MHz,MDA-MB-231的fc= 0. 26MHz） 比較發現屬于同一數量級，但高于乳腺癌細胞[1],說明特征頻率fc可以作為鑒別不同種類細胞的指標。Nyquist圖是細胞阻抗實部與虛部的關系。隨著細胞容積比值的增加，圓弧曲線整體右移、擴展，其半徑和面積增大，Re ZL和Im Zp皆增加。其主要原因在于，當細胞數量增加，細胞膜的面積增大，膜極化強度加大，在實部表現細胞阻抗增加，在虛部反映細胞能量損失增大。故通過宏觀的復阻抗平面圖可以反映微觀的細胞膜極化變化和細胞能量損失狀況。

圖1 ~圖3采用的NCM460細胞電阻抗頻譜特征參數見表1.

3. 3細胞容積比值對NCM460細胞特征參數的影響

圖4顯示了NCM460細胞的阻抗特征參數（ΔZmax,θp,Re ZL,Im Zp） 與細胞容積比值之間的散點圖，并且這些指標與CVR均呈線性關系。在不 考慮負號的情況下，這4個指標（ΔZmax,θp,Re ZL,Im Zp） 隨CVR增加而增大。其線性回歸方程分別為：ΔZmax= - 16. 36 + 1. 69CVR;θp= 1. 22- 0. 26CVR;Re ZL= 34. 59 + 21. 2CVR;Im Zp=7. 71 - 0. 6CVR.

細胞膜是由含有蛋白質的磷脂雙分子層構成，具有很低的離子通透性，可視為絕緣的殼。低頻下，細胞膜對電場中電流具有阻礙作用，細胞量的增多，細胞膜的極化強度和密度隨之增加，相當于增大了體系中的電阻，因此，Re ZL、ΔZmax（ΔZmax= ZL- Zh） 皆增加。據此特點無標記細胞增殖檢測技術得到了應用[14].如前文所述，細胞膜極化是產生β散射的原因，θ是由于極化強度跟不上電場變化而產生的相位差，θp的產生是由于在一定頻率下，細胞極化強度與電場強度達到了瞬間的飽和值（ 圖2） ,它同Im Zp一樣可被視為電場中的“損失”部分。細胞量的增多顯然會使這種“損失”增大。

4 結論

通過細胞阻抗譜的分析可以得到NCM460細胞的電阻抗特性： 阻抗幅值和相位角是電場頻率的函數； 阻抗特征參數（ΔZmax、θp、Re ZL、Im Zp） 隨細胞數量（ 細胞容積比值） 的增加而增加； 特征頻率（fc） 可 作 為 鑒 別 細 胞 的 頻 域 電 生 理 指 標。NCM460細胞通常作為結腸癌的對照組細胞，表征NCM460細胞的電學特性可為進一步探討結腸癌細胞電生理變化提供幫助。

[參考文獻]

[1]Qiao GF,Wang W,Duan W,et al. Bioimpedance analysisfor the characterization of breast cancer cells in suspension[J]. IEEE Trans Biomed Eng,2012,59（8） :2321-2329.
[2]Keshtkar A,Salehnia Z,Keshtkar A,et al. Bladder cancerdetection usingelectrical impedance technique（tabriz mark 1）[J]. Patholog Res Int,2012,（2012） :470101.
[3]Zhang D,Zhang Y,Zheng L,et al. Graphene oxide/poly-L-lysineassembled layer for adhesion and electrochemical imped-ance detection of leukemia K562 cancer cells[J]. Biosensors& Bioelectronics,2013,42（1） :112-118.
[4]Gamal W,Borooah S,Smith S,et al. Real-time quantitativemonitoring of hi PSC-based model of macular degeneration onelectric cell-substrate impedance censing microelectrodes[J].Biosens Bioelectron,2015,71（9） :445-455.
[5]Scott CW,Peters MF. Label-free whole-cell assays:expan-ding the scope of GPCR screening[J]. Drug Discov Today,2010,15（17-18） :704-716.
[6]Wang L,Wang L,Yin H,et al. Real-time,label-free monito-ring of the cell cycle with a cellular impedance sensing chip[J]. Biosens Bioelectron,2010,25（5） :990-995.
[7] 張青松。 MTA對NCM460和結腸癌RKO細胞增殖和凋亡的影響[J].第四軍醫大學學報，2008,29（5） :468-469.Zhang QS. Effects of methylthioadenosine on proliferation andapoptosis in the NCM460 cells and human colon cancer RKOcells[J]. J Fourth Mi Med Univ,2008,29（5） :468-469.
[8]Yang B,Tan Z,Song Y. Study on the molecular regulatorymechanism of MicroRNA-195 in the invasion and metastasis ofcolorectal carcinoma[J]. Int J Clin Exp Med,2015,8（3） :3793-3800.
[9] 陳林，馬青，王力，等。大鼠紅細胞懸浮液阻抗譜Cole-Cole數學模型分析[J].航天醫學與醫學工程，2010,23（3） :182-187.Chen L,Ma Q,Wang L,et al. Cole-Cole mathematical mod-el analysis on impedance spectrumin rat erythrocyte suspen-sion[J]. Space Medicine & Medical Engineering,2010,23（3） :182-187.
[10] 宮宇，馬青，陳林，等。尾 吊 大 鼠 血 液 細 胞 電 阻 抗 譜 的Cole-Cole模型分析[J].航天醫學與醫學工程，2012,25（4） :243-246.Gong Y,Ma Q,Chen L,et al. Analysis of electrical imped-ance spectroscopy of blood cells in Tail-Suspension rats withCole-Colemodels[J]. Space Medicine & Medical Engineer-ing,2012,25（4） :243-246.
[11] 方云，湯治元，張倩，等。人肝癌細胞電阻抗特性的實驗研究[J].生物醫學工程學雜志，2014,31（5） :1070-1074.Fang Y,Tang ZY,Zhang Q,et al. Experimental study on e-lectrical impedance properties of human hepatoma cells[J].Journal of Biomedical Engineering,2014,31（5） :1070-1074.
[12] 張倩，方云，董長征，等。人肺鱗癌細胞電阻抗譜測量實驗研究[J].中國生物醫學工程學報，2015,34（1） :114-118.Zhang Q,Fang Y,Dong CZ,et al. The measurement of elec-trical impedance spectrum of human lung squamous carcinomacells[J]. Chinese Journal of Biomedical Engineering,2015,34（1） :114-118.
[13]Foster KR,Schwan HP. Dielectric properties of tissues andbiological materials:a critical review[J]. Crit Rev BiomedEng,1989,17（1） :25-104.
[14] 趙靈芝，張成孝。交流阻抗法在細胞分析中應用的研究進展[J].化學通報，2015,78（1） :23-28.Zhao LZ,Zhang CX. Advances on applications of electro-chemical impedance spectroscopic method in cell analysis[J]. Chemistry,2015,78（1） :23-28.