脂肪干細胞（ adipose-derived stem cells） 來源于脂肪組織，取材方便、對自體損傷較小，具有自我更新、多向分化能力、自體移植不發生排斥反應等特點，是組織工程中最有應用前景的種子細胞之一。量很低，占 3%左右，并且分離出來的細胞純度不理想[1].因此如何獲得足夠量的、活性高的、高純度的細胞極為重要。隨著科研技術的不斷發展，研究者提出了脂肪干細胞不同的分離純化方法。本文就近年來脂肪干細胞分離純化方法的新研究進展作一綜述。

1 脂肪干細胞分離方法

1. 1 組織塊貼壁法

組織塊貼壁法即將脂肪組織剪成適宜大小的組織塊，然后將組織塊貼壁到培養瓶中進行培養[2].此法的核心是確保脂肪組織塊貼壁，但在實際操作中很難保證每塊組織塊貼壁，尤其是在換液過程中，組織塊很容易漂浮，導致脂肪組織的浪費。

Jing W 等人[3]采用組織塊貼壁法分離培養 8周齡 BALB/c 小鼠脂肪干細胞時，在脂肪組織剪碎之前，先吸取脂肪組織表面附著的多余水分，將脂肪組織塊接種到培養瓶后讓組織塊貼壁一段時間后再加入細胞培養液，這樣的處理可以使脂肪組織塊更加牢固地貼在培養瓶上。本實驗室采用此法分離脂肪干細胞時將組織塊接種到培養瓶后置于培養箱內培養 30 min 后再加入培養液，使得組織塊貼壁更加牢固[4].

1. 2 酶消化法

酶消化法為原代細胞培養常用的方法之一，原理是利用新鮮離體組織的細胞生物學特性未發生明顯的變化，仍具有二倍體遺傳特性，通過消化液去除細胞間質，使細胞能夠更好地吸收外界營養和排出代謝產物，短時間內獲得大量的活細胞。脂肪組織酶消化法即脂肪組織被剪成碎塊置于酶中消化，再通過過濾、洗滌和離心等步驟去除漂浮在上層的脂肪細胞和油脂，從而得到脂肪干細胞。JiangA 等[5]通過酶消化法從人脂肪組織中分離出脂肪干細胞，所培養的細胞貼壁生長、細胞形態為典型的長梭形成纖維樣，表達脂肪干細胞特殊的表面標記物 CD29、CD44、CD105,陰性表達造血干細胞相關的表面標記物 CD34、CD45.

酶消化法實際上是一種費時、昂貴的方法，尤其是在需要分離大量脂肪組織的時候，其弊端顯得更為突出； 在酶的種類、濃度、消化時間上存在很大差異，缺乏統一的標準，大多數研究者采用Ⅰ型膠原酶消化分離原代細胞[6],少數采用 Ⅱ 型膠原酶[7]、IV 型膠原酶、VIII 型膠原酶[8]、胰酶[9]或者膠原酶聯合應用胰酶[10]進行消化分離，酶的使用濃度從0. 05 ~ 2. 5 g/L 不等[11 -14],消化時間范圍為0. 5~ 3 h[15 -17],從而使得分離出來細胞的活性、表型、潛能存在一定的差異； 另一方面，市場上的膠原酶和胰酶純度不高，可能包含有色素、內毒素、異種抗原、異種蛋白酶體[18 -19]; 消化法獲得的脂肪干細胞不純； 人為操作過多，容易造成污染； 此外，需要的脂肪組織量較大，當脂肪組織量較少時，采用此法無法擴增出足夠量的脂肪干細胞用于后續分析[20].

Griesche N 等[21]在常規膠原酶消化法分離脂肪干細胞的基礎上作了一些改進，在消化獲得的細胞接種培養 60 min 后馬上進行換液，與常規膠原酶消化法相比，此法可以明顯減少 desmin、smA 和 six2的表達，提高干細胞標記物 nestin、oct-4 和 sall-1 的表達。Carvalho PP 等[22]使用臨床級的無異源蛋白的釋放酶消化人脂肪組織，消化獲得的脂肪干細胞活性和功能與使用科研級的膠原酶Ⅰ、膠原酶 A、膠原酶 NB4 相比無明顯區別，表明高度純化的釋放酶可替代科研級的膠原酶，減少酶中異源蛋白對脂肪干細胞的污染。Güven S 等[23]使用 sepax 裝置自動分離脂肪干細胞，方法是將樣品和膠原酶裝入轉移袋中，37℃孵育 1 h 后，轉移袋與 CS-490. 1 試劑盒相接，在 sepax 裝置中啟動 CS-490. 1 試劑盒開始自動消化，收集消化所得細胞，此裝置分離得到的脂肪干細胞比傳統的手動消化法效率高、細胞產量高、人為干預少。胡金靈等[24]分離 SD 大鼠脂肪干細胞時采用 0. 25% Ⅰ 型膠原酶消化脂肪組織30 min,離心，將獲得的細胞接種培養獲得所需的細胞，此法提高了膠原酶濃度，縮短消化時間，可減少膠原酶對細胞活性的影響； 省略了傳統膠原酶消化法中篩網過濾和紅細胞裂解兩個步驟，降低人為操作、試劑對脂肪干細胞的損傷。

1. 3 其他方法

近幾年來，除了傳統的脂肪干細胞分離方法，還有些尋求突破的新方法出現。

1. 3. 1 吸附柱法

Ito K 等[25]于 2010 年首次使用由非織造織物組成的裝置從骨髓中成功分離出間充質干細胞，分離出來的細胞表達間充質干細胞細胞表型標記物，具有成脂成骨潛能。Doi K 等[26]參照上述方法設計出一個由無紡纖維和聚乙烯織物組成的網格直徑為 100 μm 的吸附柱，此無紡纖維和聚乙烯織物對貼壁細胞具有親和力，具體方法是將抽脂產物的液體部分通過吸附柱，貼壁細胞吸附到吸附柱中，再通過逆行流沖洗出吸附柱中吸附的細胞，獲得的細胞接種培養，擴大的細胞表達脂肪干細胞相關的表面標記物，具有向脂肪細胞與成骨細胞分化的能力，成功從抽脂產物液體部分中分離出脂肪干細胞。此法可以避免酶的使用，但是僅適用于抽脂產物的液體部分，而且需要大量的樣品。

1. 3. 2 直接離心法

直接離心法的原理是通過離心收集吸脂時吸脂產物中混有的游離脂肪干細胞，將離心得到的脂肪干細胞接種培養。Shah FS 等[27]將得到的吸脂產物用磷酸鹽緩沖液洗滌，離心，分別收集上層漂浮物和下層沉淀物，上層漂浮物加入磷酸鹽緩沖液再次洗滌，離心，此過程重復 3 ~ 4 次，將每次獲得的下層沉淀物接種到培養瓶則可獲得脂肪干細胞。

此法僅適用于吸脂手術獲得的脂肪組織，并且需要大量的吸脂產物。

1. 3. 3 膠原酶消化法結合組織塊貼壁法候曉琳等[28]分離 C57BL/6J 小鼠脂肪干細胞時將Ⅰ型膠原酶消化獲得的單細胞以及未消化完全的脂肪組織塊一起接種到培養皿中，8 ~ 9 d 時細胞即鋪滿皿底。此法將膠原酶消化法與組織塊貼壁法兩種方法有機結合起來，在短時間內適度消化降低膠原酶對細胞活力損傷，同時把剩余未消化的脂肪組織塊一起接種，可以充分利用脂肪組織。不足之處是此法未與單獨采用Ⅰ型膠原酶消化法、組織塊貼壁法所獲得的脂肪干細胞在細胞產量、活性、分化潛能等方面進行比較。

2 脂肪干細胞純化方法

為獲得純度較高的脂肪干細胞，目前有學者在分離的基礎上結合相應的純化方法，以獲得研究需要的細胞，現有的脂肪干細胞純化方法如下。

2. 1 免疫磁珠分選法

免疫磁珠分選法分離純化細胞的原理是基于細胞表面抗原與連在磁珠上相應的特異性單抗結合，當單細胞懸液通過特定的外加磁場時，與磁珠相結合的細胞被吸附滯留在磁場中，未與磁珠結合的細胞則不能被吸附在分選柱內，從而使細胞得以分離。免疫磁珠分選法將細胞生物學、磁力學和免疫學等知識融于一體，具有高度特異性分選細胞的特點。Gierloff M 等[29]使用免疫磁珠分離法從培養的大鼠脂肪干細胞中分離純化出 CD29+、CD71+、CD73+、CD90+各脂肪干細胞亞群，各干細胞亞群均具向脂肪細胞分化的能力，但是 CD29+干細胞亞群的成脂能力強于 CD71+、CD73+、CD90+各干細胞亞群。

免疫磁珠分選法純化脂肪干細胞順利進行的重點側重于標記磁珠時相應抗體的選擇，若只用單一特異性標記物原則上會造成其他脂肪干細胞亞群的丟失。目前有報道用 CD29、CD44、CD49d、CD73、CD105 等作為純化脂肪干細胞的表面標記物[30].然而，至今為止研究者們對于脂肪干細胞的特異性標記物還存在一定的爭議，尤其是 CD34.

2006 年國際細胞治療協會規定 CD34 為脂肪干細胞的陰性標記物[31].隨后許多研究者也同樣認為脂肪干細胞不表達 CD34.最近幾年，越來越多的研究者發現早期培養的脂肪干細胞表達 CD34[32 -35].Baer PC[36]認為脂肪干細胞的細胞表型在體外是動態的，隨著傳代次數的增多有的細胞表型消失，有的細胞表型增加。故采用免疫磁珠法純化脂肪干細胞時選擇的抗體和細胞傳代次數很重要。此外，常用的免疫磁珠分選法如親和吸附柱、FACS 組織培養瓶鋪展貼壁、MACS 都存在一些不足之處，如實驗設備昂貴、試驗成本高、技術要求高、分離出來的細胞容易污染、對細胞活力有一定的損傷等。重要的是分離出來的細胞仍然具有人工修飾的非自身的 lg 片段，進行細胞移植治療時可能會引發一系列宿主反應，尤其是會產生活性氧，活性氧進一步引起炎癥反應，同時影響脂肪干細胞自身的修復能力[37].

2. 2 密度梯度離心法

密度梯度離心法是根據不同顆粒之間的沉降系數不同，在一定離心力作用下，不同顆粒以自己的速度沉降，在密度梯度不同區域上形成區帶，從而不同密度的細胞得到分離。杜明昌等[38]采用密度梯度離心法分離由真空負壓抽脂法吸取的豬皮下脂肪 50 g,可獲得（ 2. 1 ~ 2. 7） × 106個脂肪干細胞。

密度梯度離心法能夠順利進行在于介質的選擇和介質最佳密度的確定上，目前常用的離心介質為聚蔗糖（ Ficoll） 和經過聚乙烯吡咯烷酮處理的硅膠顆?；鞈乙海?Percoll） .Chang 等[39]研究發現利用Ficoll 分離純化出來的人骨髓間充質干細胞在成核細胞數目及集落形成率均高于 Percoll 法，且 Ficoll法純化出來的細胞顯著高表達 CD90+、CD105+、CD166+和 SH3+,認為 Ficoll 更適用于制備人骨髓間充質干細胞。Bourzac 等[40]的研究表明采用Percoll 法分離純化馬骨髓間充質干細胞的細胞產量及自我更新潛能優于 Ficoll 法。Grisendi 等[41]用1. 073 g / mL、1. 077 g / mL 兩種不同密度的 Ficoll 分離純化骨髓間充質干細胞，結果顯示，前者所得細胞在免疫熒光表達實驗中更具有活力，成纖維細胞集落形成單位高出后者 1. 5 倍，細胞產量高出后者1. 8 倍。上述研究表明使用不同介質、不同密度的同一種介質體外分離純化骨髓間充質干細胞時對細胞的活性、產量、表型有著不同程度的影響，然而密度梯度離心常用介質是否對脂肪干細胞的各方面存在影響還不得而知。

3 小結

尋找一種操作簡單、可控性強、經濟的脂肪干細胞分離方法一直是學者們研究的重要內容?，F有脂肪干細胞的分離方法種類較多，都存在一些缺點。組織塊貼壁法在操作中保證脂肪組織塊牢固貼壁是一個難題。酶消化法需要在酶的種類、濃度、消化時間上制定統一標準。有研究表明采用組織塊貼壁法分離出來的脂肪干細胞產量高于酶消化法，所得細胞活性、細胞表型、成脂成骨分化能力與酶消化法相比無明顯區別[3,20].若能解決組織塊貼壁法組織塊貼壁難的問題，那么組織塊貼壁法將是一種前景可觀的脂肪干細胞分離方法，因為組織塊貼壁法既可避免酶的使用對細胞各方面造成的潛在影響，又具有經濟實惠、可控性比酶消化法強的特點。其他脂肪干細胞的分離方法雖然在一定程度上可以彌補傳統方法的一些缺點，但是仍然不能解決現有脂肪干細胞分離方法存在的不足。要獲得高純度的脂肪干細胞，緊接細胞分離后即可進行細胞純化，免疫磁珠分選法所使用的設備和抗體比較昂貴，不適用于一般的科研試驗和臨床研究。

密度梯度離心法所使用的試劑和設備比免疫磁珠分選法所采用的試劑和設備相對來說便宜很多，而且分離出來的脂肪干細胞純度較高，若能弄清楚離心介質是否對脂肪干細胞各方面造成影響，則密度梯度離心法將是比較理想的脂肪干細胞純化方法。