卵母細胞體外成熟（IVM）是指將不成熟的卵母細胞，在體外模擬體內成熟的微環境，培養至成熟卵子（MⅡ）的過程。此項技術開始于動物實驗，早在1935年Pincus發現兔子的不成熟卵可以在體外成熟，并且這個成熟過程是自發的。
30年后，Edwars提出人類的不成熟卵母細胞可以體外發育成熟，并且通過實驗證實其成熟過程需要至少24h.在卵母細胞的成熟過程中顆粒細胞通過縫隙連接傳遞多種信號，參與卵母細胞減數分裂的啟動以及卵胞漿的成熟。有研究表明，對顆粒細胞卵母細胞復 合體（Cumulus-oocyte comeplexes,COCs）行IVM時，體外成熟率與受精率顯著提高[1].不過，也有試驗證明，顆粒細胞存在與否，并不能影響IVM的結局，甚至對卵母細胞的成熟與受精有負面影響[2].本文以顆粒細胞與卵母細胞的聯系及信號傳遞為切入點，探討在不同培養條件下的DOs能 否 達 到 和COCs相近的效果，更深層次研究顆粒細胞在IVM過程中的影響及作用，從而為DOs體外成熟創造更適合的培養環境。
1資料與方法
1.1實驗動物
8~12周齡體重>25g健康CD-1小鼠（雌性40只，雄性10只）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養在控溫控濕及人工光照的條件下，自由飲水、采食。
1.2 IVM培養基IVM基礎培養
液購自瑞典vitrolife公司的卵裂期培養液（G1）；促卵泡生成素由瑞士Serono公司生產，劑量為75IU/支；HCG由瑞士Serono公司生產，劑量 為5 000IU/支。將 上 述 試 劑 配 置 成 含FSH75IU/L和HCG150IU/L的IVM培養液[3],并用配好的培養液制備四孔皿，每孔放0.5~0.8ml覆蓋礦物油，放在37℃、CO2濃度為6%培養箱中溫浴不少于6h備用。
1.3卵母細胞收集
雌鼠腹腔注射HMG10IU,48h后頸椎脫臼處死并取出卵巢。清除卵巢表面的結締組織置 于MOPS工作液中反復清洗。用1ml注射器穿刺卵巢表面，收集COCs.
1.4雄鼠精子收集選取8~12周、體重>25g健康活躍的雄性小鼠，脫臼處死，打開腹腔用拉細的玻璃管刺破附睪，將獲取的精子移入到預先平衡好的G-IVF中，培養2h以上備用。
1.5卵母細胞體外培養
培養箱設定溫度37℃，CO2濃度6%.卵母細胞培養24h后，觀察成熟度，排出第一極體的視為成熟卵[4],實施單精子顯微注射技術（intracytoplasmicsperm injection,ICSI），受精后移入卵裂期培養液（G1）繼續培養觀察。
1.6觀察指標
培養24h后觀察卵母細胞成熟度。胞漿均勻清晰，有第一極體（first polar body,PB1）排出的卵為成熟卵（MⅡ期卵）。沒有PB1排出，也沒有生發泡（germinal vesicle,GV）的為MⅠ期卵。胞漿顆粒較粗，顏色較深，有一個完整的細胞核，核膜清晰，核仁單個折光明顯，此為GV期卵。
ICSI后16~18h出現雙原核視為受精。胚胎評級依據卵裂球的大小、形態、發育速率，胞漿均勻情況及無核碎片的量，分為4個等級：分為4個等級：
1級：卵裂球大小均勻、形態規則，透明帶完整；胞質均勻清晰；胚胎內無核碎片<10%.2級：卵裂球大小略不均勻、形態略不規則；胞質可有顆?，F象；胚胎內碎片10%~20%.
3級：卵裂球大小明顯不均勻、可有明顯形態不規則；胞質可有明顯顆?，F象；胚胎內碎片21%~50%.4級：卵裂球大小嚴重不均勻；胞質可有嚴重顆?，F象；胚胎內碎片>50%.培養至第三天，卵裂球數目≥7且評級≥2級為優質胚胎。
1.7統計學方法應用SPSS 11.0軟件包進行統計學分析，計量資料用單向方差分析（One-Way ANOVA），計數資料采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05.
2結果
2.1三組卵母細胞成熟率的比較三組成熟率比較差異無統計學意義 （P >0.05）。但A、B二組的成熟率略高。見表1.
2.2三組卵母細胞受精率及后續發育比較A、B二組相對于C組有較高的受精率和優質胚胎率，差異有統計學意義（P<0.05），A、B二組之間的差異無統計學意義（P<0.05）。見表2.
3討論
哺乳動物的卵母細胞表面包繞著多層排列緊密的顆粒細胞，它們與卵母細胞存在廣泛而復雜的聯系，在卵母細胞生長發育及成熟分裂過程中起著非常重要的作用。通過電鏡觀察，卵母細胞的細胞膜（卵黃膜）有許多微絨毛突向透明帶，與外層的顆粒細胞形成聯系。通過這些結構，顆粒細胞可以向卵母細胞提供營養物質、傳遞信號，這是多種激素、因子作用于卵母細胞的媒介[5]:
①促性腺激素作用于顆粒細胞，調節cAMP的合成及傳遞，調節卵母細胞成熟的進程。
②顆粒細胞在促性腺激素的作用下分泌甾體激素，體外培養中在有甾體激素的存在下卵母細胞后期發育更好，這可能與胞漿更成熟有關。
③顆粒細胞中cAMP依賴的MAPK通路激活是卵母細胞核成熟所必要的。
④顆粒細胞合成的激活素和抑制素能調節促性腺激素特別是FSH的分泌，在卵母細胞成熟中發揮重要作用。體外培養過程中，低濃度的顆粒細胞可以促進卵母細胞成熟分裂，高濃度的顆粒細胞作用則相反。這可能因為，更多的顆粒細胞能合成更多的cAMP,導致 卵母細 胞內cAMP升高，抑制減數分裂的重啟。所以，有學者主張培養液中加入顆粒細胞，用以延緩核成熟，從而讓胞漿與胞核成熟更加同步。
大量數據證明顆粒細胞能促進卵母細胞胞漿的成熟[6],脫去顆粒的未成熟卵母細胞即使發育成熟，也不能正常受精及發育[7].卵母細胞在體外的培養環境與體內不同，在處理卵母細胞和脫顆粒的過程中，丟失了卵泡膜細胞、卵丘細胞和卵泡液，這會導致減數分裂抑制因子尤其是cAMP的合成減少，又由于卵泡液中抑制成分丟失，失去了抑制成分的卵母細胞可以激發減數分裂，核成熟的進程不被控制。
由此可見，離體的未成熟卵母細胞可自發的核成熟，這可能是一個自動程序。盡管卵母細胞的生長依賴于顆粒細胞，但在成熟分裂的過程中顆粒細胞不被依賴。本次實驗證實DOs與COCs有相近的成熟率。卵母細胞表明沒有促性腺激素的受體，失去了激素及顆粒細胞的作用DOs的胞漿很難成熟，而細胞核成熟仍可自發進行。
此時的卵母細胞胞漿與胞核發育極不同步，導致了受精率低下、多精受精、發育潛能差等諸多問題，嚴重影響成功率。因此我們需要采取措施來延緩核成熟的進程及促進卵胞漿的成熟：將DOs與COCs混合培養，希望顆粒細胞合成的cAMP、雌孕激素以及自分泌和旁分泌的活性因子能對DOs產生影響。本次試驗顯示，單獨培養的DOs雖有不錯的成熟率，但其成熟后的胚胎發育不佳。這是因為缺乏了顆粒細胞對卵母細胞成熟的調控，卵胞漿和細胞核成熟很難同步，出現了胞漿不成熟但細胞核卻率先成熟的卵子。同時本此試驗也證實與COCs混合培養的DOs與單獨培養的COCs有相近的成熟率及發育潛能。這可能因為COCs體外培養中，在Gn的作用下顆粒細胞自分泌和旁分泌的活性物質可以影響臨近的DOs[8],并且裸卵仍有顆粒細胞埋入透明帶的部分，用來傳遞各種信號[91.
這些信號調控了卵母細胞的成熟，使胞漿與胞核發育更加同步。
4參考文獻：
[1]人未成熟卵母細胞培養體系研究進展[J].生殖與避孕，2014,（5）：388-394.
[2]Takashi Nauai,Nobuhiko Yamauchi,Kazuhiro Kiku-chi.Nuclear and cytoplasmic maturation in vitro ofporcine oocytes[J].Journal of Reproduction and De-velopment,2001,147:55-61.
[3]洪焱，黃繪，駱榮，等.培養液中添加不同促性腺激素對卵母細胞體外成熟的影響[J].生殖與避孕，2011,31（12）:833-837.
