神經科學是現代科學中進展最為迅猛的研究領域之一，體外原代培養神經細胞的形態學特性及生長發育特征與體內非常相似，較少受到體內循環、內分泌等因素的影響，且便于直接觀察、檢測指標，已成為神經科學研究中必不可少的模型工具，細胞培養的質量將直接影響研究工作的進展[1 -3].
神經元原代培養是指從活體獲得細胞或組織在體外條件下進行的第一次培養，當從胚胎腦組織中分離培養神經元時，由于他們已在原位組織完成分裂時分化，所以培養的神經元將不再會分裂、增殖，這使神經元培養與其他種類體細胞培養相比有很大的不同[4].目前，原代皮質神經元培養的方法有很多，本研究參照相關文獻[5 -9],對機械吹打法、胰蛋白酶消化法以及木瓜蛋白酶法進行比較研究，并在其基礎上進行了實驗細節的改良，旨在探討穩定適當的神經元培養方法及上述三種方法在皮質神經元培養中各自的優缺點，為研究工作者根據各自條件選擇合適的培養方法提供理論依據。
1 材料與方法
1. 1 材料
1. 1. 1 主要試劑及配制
多聚賴氨酸（ L-polysine） ,L-半胱氨酸（ L-cyste-ine） ,胰蛋白酶（ tripsin） ,木瓜蛋白酶 （ papain） ,聯咪二苯吲哚（ DAPI） : Sigma 產品； D-Hank's 平衡液，馬血清： Thermo 產品； DMEM 培養液，雙抗（ 青霉素，鏈霉素） : Corning Cellgro 產品； Neurobasal Medi-um,B27 培養基添加劑： Gibco 產品。胎牛血清： 上海依科賽生物制品有限公司； 兔抗大鼠 NSE 單克隆抗體，FITC 標記抗兔 Ig G（ Abcam） .
L-polysine 打底液： 用滅菌 ddH2O 配至工作濃度 50 μg/mL.Tripsin 消化液： 用 D-Hank's 溶液溶解配至工作濃度0. 125%; 木瓜蛋白酶消化液（ papa-in） : 用 D-hank' s 溶液配至工作濃度 200μg / mL,現用現配； 接種液配制（ 體積分數） : DMEM 83. 5%,胎牛血清 10%,馬血清 5%,雙抗 1%,L-半胱氨酸1% ; 神經元培養液（ 體積分數） : Neurobasal Medium98% ,B27 2% .所有配制液體均用 0. 22 μm 篩網過濾。
1. 1. 2 實驗動物
孕 16 ~18 日齡 SPF 級 SD 大鼠 1 只，雌性，350~ 400 g ,由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供[SCXK（ 湘） 2013 -0004].
1. 2 方法
1. 2. 1 神經元培養
包被： L-polysine 打底液包被六孔板，在 37℃孵箱孵育 30 min 后吸棄液體，晾干過夜后用滅菌ddH2O 洗板兩次，置于 37℃ 孵箱孵干備用。取材：斷頸處死孕 16 ~18 d SPF 級 SD 大鼠，并在無菌條件下取出胎鼠； 剝離胎鼠腦膜，取頂、顳葉大腦皮層的薄層腦組織置于 DMEM 溶液中，進一步剝去未分離的腦膜，并將腦組織剪碎成約 1 mm3大小，然后將腦組織與 DMEM 溶液的混合液分別移入 3 個無菌培養皿，分別標記為機械吹打組、胰酶消化組、木瓜蛋白酶消化組。分離、培養： 機械吹打組： 對培養皿中剪碎腦組織吹打 30 次，移入 15 mL 無菌離心管，離心 5 min 1000 r/min.加入 3 mL 接種液后分層吹打，即： 吹打 10 次，靜置 2 min,取上清液，再吹打 10 次后，取上清液入離心管，再吹打 10 次后，取上清液入另一無菌離心管。
臺盼蘭拒染法進行活細胞計數，調整細胞密度（ 1. 0 ×106個細胞/孔） ,接種于經包被的培養板中，置于 37℃，5% CO2的孵箱內孵育； 胰酶消化組： 在盛有大鼠腦組織的無菌培養皿中加入 2 mL 胰酶消化液，混勻，37℃水浴箱消化 15~ 20 min,5 min 觀察、搖勻，然后加入等體積于胰酶消化液的胎牛血清終止消化，并轉移至 15 mL 無菌離心管中，吹打后離心 5 min,1000 r/min,棄上清，加入5 mL 接種液重懸細胞，按前述分層吹打步驟吹打細胞，計數，接種，孵育； 木瓜蛋白酶消化組： 在盛有大鼠腦組織的無菌培養皿中加入 3 mL 木瓜蛋白酶消化液，混勻，37℃ 水浴箱消化 20 ~ 30 min,每 5min 搖勻一次，將消化后的組織轉移至 15 mL 無菌離心管中，吹打后離心 5 min,1000 r/min,棄上清，加入5 mL 接種液重懸細胞，按前述分層吹打步驟吹打細胞，計數，接種，孵育； 各組孵育 4 h 后，全量換為神經元培養液，72 h 后全量換液，以后視細胞生長情況，3 ~ 4 d 半量換液，倒置相差顯微鏡下觀察生長狀況。
1. 2. 2 神經元鑒定
免疫熒光鑒定 NSE: 4℃ PBS 洗細胞 3 次，4%多聚甲醛室溫固定細胞 10 min,吸去多聚甲醛，PBS洗 3 次。用 0. 12% Triton X2100 的 PBS 對細胞進行透化處理15 min,然后加入封閉液，室溫封閉1 h.換為相應一抗（ 兔抗大鼠 NSE 單克隆抗體） 4℃濕盒過夜，PBS 清洗 3 次后加入 FITC 標記的抗兔二抗，室溫避光孵育 1 h.然后加入用 DAPI 室溫染細胞核 5 min（ 避光） .PBS 漂洗 3 次。90% 甘油封片。
熒光顯微鏡下觀察 NSE 表達陽性細胞，隨機取 8 個視野，攝像后計算每個視野中 NSE 表達陽性細胞數占該視野總細胞數的比例，即為神經元純度。
1. 2. 3 統計學處理
應用 SPSS 18. 0 分析軟件進行方差分析，P <0. 05 視為有統計學差異。
2 結果
2. 1 形態學觀察
培養的皮層神經元細胞在接種 4 h 后大部分貼壁，多數貼壁細胞成圓球狀，少數細胞出現較小突起，呈蝌蚪樣（ 圖 1A、2A、3A） ,6h 后可見明顯的細胞突起； 至第 24 h 神經元細胞完全貼壁，光暈明顯，突起伸長，可見軸突形成稀疏的網絡（ 圖 1B、2B、3B） ,隨著培養時間延長，神經元細胞軸突形成的網狀結構漸趨密集，3 d 后神經元胞體變大，細胞呈現多樣性，多為紡錘形、三角形及圓形。細胞突起增粗伸長，可見雙極或多極神經元，細胞突起交織成疏散的網狀結構，視野中偶見不規則扁平的膠質細胞（ 圖 1C、2C、3C） .培養 7 d 后神經元胞體進一步增大且突起延長，形成復雜緊密的神經元網絡（ 圖 1D、2D、3D） ,此時，神經元成熟穩定，可以作用實驗模型用于進一步實驗。
2. 2 神經元鑒定
原代細胞中神經元所占比例高，形態良好，核大而清晰（ 圖 2: 4A、5A、6A） .免疫熒光染色結果顯示NSE 陽性細胞在機械吹打組（ 圖 2: 4B） 、胰酶消化組（ 圖2: 5B） 及木瓜蛋白酶消化組（ 圖2: 6B） 分別為96. 28% ,95. 63% ,97. 34% ,三組間無統計學差異（ P >0. 05） .
3 討論
神經細胞培養是神經生物醫學領域研究的一項重要技術。原代培養的神經細胞在 Alzheimer's 病及帕金森病等中樞神經系統疾病以及氯胺酮、甲基苯丙胺等神經系統藥毒物研究中備受關注，已經成為神經科學研究中重要的實驗材料及模型工具[8].
本研究改良實驗條件，運用三種方法培養大鼠的體外培養皮質神經元，光鏡下可見神經元形態多為紡錘形、橢圓形及三角形，突起相互交織成網狀，具有神經元的形態學特征，經免疫熒光染色，隨機選取視野計數后，神經元陽性細胞百分率均大于95%.提示三種方法均培養出高純度及發育成熟的神經元。
神經元原代培養主要有以下步驟： 首先是實驗動物的選擇，將胎齡為 16 ~ 18 d 的 SD 大鼠胚胎作為實驗材料，此胎齡的胎鼠皮層神經元尚未發育成熟，抵抗損傷的能力較強，而膠質細胞數量甚少，利用此階段的大鼠胚胎提取神經元可以提高細胞的成活率并能較好地控制雜質細胞的百分含量； 再者取材過程中血管膜剝離是一個重要的步驟，若剝離不完全易導致神經元分離困難，繼發吹打過度而造成神經元大量死亡，且血管膜的細胞會混入原代培養中，嚴重干擾實驗結果，胎鼠的血管膜較新生鼠易剝離，可以提高實驗的成功率[10,11].
其次是取材，SD胎鼠從母鼠腹腔取出至腦皮層剪碎過程需時較長，易造成神經元損傷甚至死亡，多文獻中提出保持實驗過程在冰上且冰浴的培養液中進行，可以大大提高神經元的存活率。此外，在解剖過程中，D-Hanks液的無糖環境對神經元很不利，本實驗用 DMEM 溶液浸泡解剖過程中的大腦，保持大腦的代謝活性，可提高神經元的存活率。在最后的神經元分離培養過程中，制作活性較高的單細胞懸液是培養過程中至關重要的步驟，制備神經元單細胞懸液的方法主要有兩種： 機械吹打法與酶消化法。
其中吹打是一個關鍵的步驟，用槍頭緩慢吹打就可以達到好的效果，切忌過快，吹打過快可以導致大量神經元死亡形成細胞碎片。分層吹打法取代過篩可以避免過篩可能導致的細胞丟失和損傷。而在消化分離過程中，使用酶消化時用 35 mm 或者 60 mm 培養皿盛放酶消化液，使消化液在培養皿里形成淺而廣闊的一層，均勻分布著組織塊，避免神經元部分消化不足，部分消化過度導致的損傷甚至死亡。在培養過程中，有血清培養可以在種植初期促進細胞快速恢復狀態，適應環境及穩定生長，但血清刺激膠質細胞和雜細胞分裂，影響神經元的純度，導致細胞狀態不均一，可能對后續實驗造成不良影響[6],而使用 NeurobasalMedium 及 B27 可以提高神經元培養的純度，非神經元細胞明顯減少，神經細胞突起分化早、伸展快。
本實驗采用含血清種植液種植細胞，而用無血清飼養液維持細胞的存活和生長，綜合雙方的優勢，更有利于后續實驗的進展[6].
本實驗運用孕 16 ~18 d SD 大鼠胚胎作為實驗對象，在實驗細節方面進行改良如 DMEM 溶液浸泡解剖后的大腦、分層吹打法代替過篩離心等操作及培養皿盛放酶消化液進行消化等，力使細胞培養過程中，節省實驗時間，降低污染，使神經元的損傷達到最小化，提高神經元培養的存活率。并且利用改良的實驗條件，分別運用三種不同方法均能成功培養出含雜質量較少且純度高的皮層神經元，其在不同生長階段具有典型的形態學特征，每種培養方法都有其不同的特點。
機械分離法中用機械分離代替酶消化，其優點在于： 輕輕吹打對細胞的損傷小，細胞活性保持很好，并且操作流程簡單； 節約操作時間，減少污染。
但是消化結果的穩定程度與操作人員熟練程度相關，易形成難以消除的組織團塊。胰蛋白酶消化是一種生化和化學性分離技術，而胰蛋白酶消化與pH、濃度、溫度和消化時間有關，濃度的大小、消化時間的長短都會直接影響到細胞的產率和活性，此外，消化之前要掌握好皮質組織塊剪碎的大小以及吸管吹打程度，以利于對胰蛋白酶消化時間的控制，而胰蛋白酶消化的徹底與否，直接關系到神經元的生長活性。因此，胰蛋白酶的濃度和作用時間需要嚴格控制，需要多次摸索實驗條件。木瓜蛋白酶是消化過后神經元存活率最高的酶[5,6],木瓜蛋白酶的特點是不會過度消化，非常溫和。缺點是需要用無血清的培養液配來保證神經元的營養代謝，而且一定要現用現配，價格較前兩種方法昂貴，且木瓜蛋白酶消化法消化時間最長，需要 30 min 左右，具體消化時間需要實驗摸索確定。
隨著神經元將被越來越廣泛的應用于包括細胞功能、神經發育、退行性疾病、神經藥毒理學等在內的多領域、多層次的研究[12 -17],神經元原代培養作為體外實驗研究的工具愈顯重要。本實驗改良并比較了三種原代神經元培養的方法，為研究工作者根據各自條件選擇合適的培養方法提供實驗證據和理論依據。
參考文獻：
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[2] 鄂征。 組織培養技術及其在醫學研究中的應用 [M]. 北京：中國協和醫科大學出版社，2004: 65 -69.
[3] Robert F,Cloix JF,Hevor T. Ultrastructural characterization ofrat neurons in primary culture [J]. Neuroscience. 2012,200:248 - 60.
[4] 薛麗，水克娟，呂朝軍，等。 神經細胞培養方法概述 [C].中國植物保護學會。 科技創新與綠色植保-中國植物保護學會 2006 學術年會論文集。 中國植物保護學會，2006: 6.
