角質形成細胞是鱗狀上皮細胞的主要組成成分，具有廣泛的生物學特性。常見的鱗狀上皮細胞有皮膚和口腔黏膜上皮細胞，當其出現大面積損傷時創口自身不能正常愈合，只能通過組織移植來補償缺損的組織面。皮膚或口腔黏膜是容易接觸一些藥物或材料刺激的組織，因此探討皮膚或口腔黏膜組織對于臨床藥物和材料的反應是重要的研究課題。
體外細胞檢測模型一般來自患者的原代培養細胞或來自腫瘤、遺傳物質突變的轉化細胞系，但原代細胞培養獲得的細胞有限，傳代后組織特異性也逐漸喪失，且組織來源不同的原代細胞培養所得出的測定數據差異較大，不是毒理學研究的理想細胞； 轉化細胞容易獲得并易于維持，穩定性高，可重復性好，但其具有腫瘤細胞的特性，例如生長失去控制、接觸抑制喪失、細胞外形改變、核型異常等[1],也不是毒理學研究的理想模型，因此，急需建立新的外源性化合物安全性的評價模型。人胚胎干細胞（ hu-man embryonic stem cells,hESCs） 是健康和永生的單一胚胎細胞來源的人類樣本，既可真實反映人類生物學特征[2],又可通過單一胚胎細胞無限增殖和定向分化達到樣本高度標準化[3],可能成為預測受試物細胞毒性和遺傳毒性的體外替代實驗模型[4],為體外安全性評價提供了新的希望。將 hESCs 誘導分化為角質形成細胞目前暫無標準化方法，研究發現通過形成擬胚體（ embryonic body,EB） 的方法獲得的角質形成細胞增殖能力過低，不利于組織發育[5]; 2008 年，Metallo 等[6]用直接誘導法將 hESCs誘導分化為上皮細胞的前體細胞，并比較了 EB 法和直接誘導法誘導 hESCs 5 周后獲得的細胞角蛋白（ cytokeratin,CK） 14 的陽性表達率（ 15% vs. 87%） ,發現直接誘導法具有顯著的優勢。
人永生化口腔上皮細胞系（ human immortalizedoral epithelial cells,HIOECs） 是用人乳頭瘤狀病毒E6、E7 開放讀碼框架轉染原代培養的正?？谇簧掀ぜ毎蠼⒌腫7],HIOECs 具有與口腔黏膜上皮細胞相似的形態和生化特性，所建模型可被用于評價藥物在口腔吸收機制的研究[8].人永生化皮膚角質形成細胞 HaCaT 是由成人皮膚轉染猴空泡病毒40（ simian virus,SV40） 后發生自分化的未成瘤的永生化皮膚角質形成細胞系[9].
本課題組前期實驗亦通過直接誘導法將 hESCs誘導分化為上皮樣細胞[10],但尚不清楚所得到的上皮樣細胞是否仍保持正常的染色體核型，其進一步分化是趨向于發展為皮膚上皮還是口腔黏膜上皮，以及能否作為將來毒理學的檢測模型。本研究對得到的上皮樣細胞進行了染色體核型的分析，在基因水平上探討了由 hESCs 誘導 K-hESCs 過程中多能性標志物及上皮相關標志物的表達變化； 并以人原代牙齦上皮細胞 （ human gingival epithelial cells,HGECs） 、HIOECs 和 HaCaT 作為對照細胞，通過實時定量熒光 PCR 方法檢測了其誘導末期人胚胎干細胞源角質形成細胞（ keratinocyte derived from hu-man embryonic stem cells,K-hESCs） 與對照細胞上皮相關標志物基因表達的差異性； 在蛋白水平上，通過免疫組織化學方法探討了多種上皮細胞相關標志物在 K-hESCs 和對照細胞中的表達差異。
1 材料與方法
1. 1 材料
研究所用明膠、Matrigel 購自美國 BD 公司，胚胎干細胞完全培養基（ mTeSR1） 購自美國 Stem Cell公司，中性蛋白酶購自德國 Roche 公司，CK、波形蛋白（ vimentin,VIM） 抗體購自美國 Santa Cruz 公司，細胞培養瓶及培養皿購自美國 Corning 公司，通用型二步法檢測試劑盒購自美國 GBI 公司，TritonX-100 購自美國 Amresco 公司，Gimsa 染液購自北京Solarbio 公司； 其他研究所用材料全部購自美國Invitrogen 公司。
1. 2 細胞培養
1. 2. 1 hESCs 的培養 人胚胎干細胞系 H9 （ H9-hESCs） 由新加坡國立大學提供，將其培養于 Matri-gel 上，培養液為胚胎干細胞完全培養基，每天換液，細胞接近匯合時用 1 g/L 的中性蛋白酶，37 ℃消化5 min,機械刮除，800 r / min 離心 5 min,1 ∶ 6 傳代。
1. 2. 2 HGECs 的原代培養 選擇擬行阻生牙拔除術、無口腔黏膜疾病且冠周齦組織無炎癥表現的患者，術前征得患者同意，術中收集拔除牙齒上附帶的牙齦組織，采用組織塊法在無血清上皮培養基（ de-fined keratinocyte serum-free medium and supplement,D-KSFM） 中培養獲得 HGECs.本研究獲得北京大學生物醫學倫理委員會批準（ 批準號： PKUSSIRB-201310055） .
1. 2. 3 HIOECs 及 HaCaT 培養 分別使用 D-KSFM和含 10%（ 體積分數） 血清的 DMEM 高糖培養基培養 HIOECs 與 HaCaT,傳代時均用胰酶 37 ℃分別消化 5 min 和1 min,用含血清培養基中和，前者600 r/min 離心 10 min,后者 1 000 r / min 離心 5 min,1 ∶ 3傳代。
1. 3 誘導 hESCs 分化為 K-hESCs.H9-hESCs 常規傳代后第 2 天，將 hESCs 完全培養基 換 成 上 皮 分 化 誘 導 液 （ 體 積 分 數 98% 的DMEM / F12 培養基，含有 1 × N2 補充成分、1 μmol /L 維甲酸、25 μg / L 骨形成蛋白 4） ,每天換液，連續誘導 7 天，第 7 天傳代。傳代時用 1 g/L 的中性蛋白酶，37 ℃消化 5 min,機械刮除，D-KSFM 重懸，200 × g 離心 4 min,D-KSFM 重懸輕吹勻，1 ∶ 3 傳代至明膠鋪被的板子上，晃勻，隔天換液。P1 代第 10天時 K-hESCs 用胰酶 37 ℃消化 1 min,含血清培養基中和，200 × g 離心 4 min,D-KSFM 重懸輕吹勻，1 ∶ 1 傳代至明膠鋪被的板子上，晃勻，隔天換液。
1. 4 Real-time PCR 檢測方法。
Trizol 法提取細胞總 RNA,取 2 μL RNA 檢測純度和濃度，20 μL 體系逆轉錄為 cDNA,以 GAPDH 為內參，PCR 引物序列見表 1,20 μL 體系在7500 實時PCR 檢測儀（ 美國 ABI 公司） 上行定量 PCR 檢測。
1. 5 免疫細胞化學檢測
將細胞均勻接種在無菌的載玻片上，待貼壁生長至合適密度后，95% （ 體積分數） 乙醇固定 30min,PBS 沖洗，0. 1% （ 體積分數） Triton-X 100 室溫處理 15 min,PBS 沖洗； 10% （ 質量分數） H2O2室溫處理 10 min,PBS 沖洗； 滴加一抗，4 ℃ 過夜。第 2天滴加二抗試劑，室溫孵育 30 min,PBS 沖洗； DAB室溫顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。
SOX2[SRY-related high-mobility-group （ HMG） -box protein-2 ]、OCT4 （ octamer-binding transcriptionfactor-4） 、CK1、P63 以核內有著色顆粒為陽性判斷標準，余以細胞漿內有著色顆粒為陽性判斷標準。采用半定量分析判定陽性表達強度，無著色顆?；蜿栃约毎麛瞪儆?5% 為陰性（ - ） ,著色且著色總面積在5% ~10%為弱陽性（ +） ,著色總面積在 11%-50% 為中等陽性（ + + ） ,著色總面積大于 50% 者為強陽性（ + + +） .
1. 6 二倍體檢測
生長狀態良好的 K-hESCs,加入 0. 012 mg/L 秋水仙素培養 8 h,收集細胞，加入預溫至 37 ℃ 的0. 075 mmol / L KCl 溶液 5 mL,置 37 ℃ 15 min,用3 ∶ 1 甲醇冰醋酸固定 3 次，滴到預冷的載玻片上，70 ℃ 3 h 烤片。Gimsa 染色 10 min,水洗，顯微鏡下觀察染色體并進行核型分析。
1. 7 統計學分析
利用 SPSS 16. 0 軟件進行統計學分析，采用多組間比較的單因素方差分析、成組設計多個樣本比較的秩和檢驗（ Kruskal-Wallis 法） 及完全隨機設計兩獨立樣本的秩和檢驗分析方法，P < 0. 05 為差異有統計學意義。
2 結果
2. 1 培養細胞形態和鑒定
2. 1. 1 細胞形態 原代培養的 HGECs 呈鋪路石樣緊密排列的上皮樣細胞形態，細胞大小一致，形態規則，細胞核清晰（ 圖 1A） ; HIOECs 為分散生長的多角形上皮樣細胞，細胞大小較一致，生長較慢（ 圖 1B） ;HaCaT 細胞呈克隆狀聚集生長，細胞為多角形，長滿后也為鋪路石樣，生長較快（ 圖 1C） .未分化的H9-hESCs在 Matrigel 上細胞成團克隆狀生長，飽滿厚實，排列緊密，形似鳥巢，細胞之間界限不清，胞體體積小，核大，有1 個或幾個核仁，細胞增殖并保持未分化狀態（ 圖1D） .用上皮分化培養基誘導得到的 P1代細胞以組織塊貼壁細胞為中心呈現克隆狀生長，細胞呈鋪路石狀，排列緊密； 以小圓形、多角形為主的上皮樣細胞，克隆中央的細胞較小且排列較緊密，克隆周圍的細胞較大且大小較一致，細胞核清晰（ 圖 1E） ,類似于 HGECs,我們將其稱為人胚胎干細胞源角質形成細胞 K-hESCs.從 P1 代第 8 天開始，克隆周圍的細胞開始收縮卷邊，細胞變大、變長且細胞內出現空泡和顆粒，細胞間連接變稀疏，到第15 天左右大多數細胞凋亡。P2 代細胞貼壁量較少，分散生長，細胞增殖速度變慢，細胞形態改變，表現為胞體變大、核模糊、出現空泡、死亡脫落（ 圖 1F） .
2. 1. 2 細胞鑒定 細胞免疫化學的實驗結果顯示，原代培養的 HGECs,CK 表達陽性（ 圖 2A） ,VIM 表達陰性（ 圖2B） ; H9-hESCs 的 SOX2 及 OCT4 表達陽性（ 圖 2C 和 2D） .9 種上皮相關標志物在 hESCs、K-hESCs（ P0 代及 P1 代） 和 HaCaT 中的免疫組織化學染色結果見表 2 和圖 3.
2. 2 Real-time PCR 結果
在 H9-hESCs 誘導為 K-hESCs 的過程中，胚胎干細胞多能性標志物 OCT4 和 NANOG 基因的表達直線下降，角質形成細胞干性標志物 CK18 和 p63基因的表達整體呈現先上升后下降趨勢，而 CK14基因的表達在 P0 代稍微下降，在 P1 代呈不斷上升趨勢。H9-hESCs 與 P1 代第 7 天時的 K-hESCs 相比，OCT4、NANOG、CK18、p63、CK14 的表達差異均有統計學意義（ 配對 t 檢驗，P 分別為 0. 016、0. 023、0. 011、0. 030、0. 013,圖 4） .
比較角質形成細胞標志物 p63、CK18、CK14 在K-hESCs （ P1 代 第 7 天 時 ） 、HGECs、HIOECs 及HaCaT 中的基因表達差異。 由圖 5 可見，與 K-hESCs 相比，基因 p63 在 HGECs 和 HIOECs 中的表達差異均無統計學意義（ P = 0. 245、P = 0. 439） ,但基因 p63 在 HaCaT 中的表達遠遠高于 K-hESCs（ P =0. 036） ; CK18 在 K-hESCs 中表達最高，但與HGECs、HIOECs、HaCaT 相比，差異并無統計學意義（ F =0. 575,P =0. 640） ; CK14 在 HGECs 中表達最高，與 K-hESCs 相比差異有統計學意義（ P <0. 001,且其在 HIOECs 和 HaCaT 中的表達與 K-hESCs 相比差異亦有統計學意義（ P =0. 001、P <0. 001） .
2. 3 二倍體檢測K-hESCs 染色體核型為正常女性（ 46,XX） ,無結構異常（ 圖 6） .
3 討論
2006 年誘導多能性干細胞（ induced pluripotentstem cells,iPS） 的出現被認為有巨大的潛在應用價值，在建立體外病理模型方面有一定的方便性，但與胚胎干細胞相比，iPS 要多經歷分離、純化、擴增、誘導去分化、篩選、建庫、擴增等步驟才能誘導定向分化，這一體外過程復雜而漫長，細胞傳代數過高對細胞的遺傳穩定性、表觀遺傳特性和生物學特性都構成了極大的不穩定，iPS 細胞即被證明帶有自身的表觀遺傳印記和端粒異常，有數百個基因存在異常表達[11 -13].本文旨在建立健康安全評價檢測模型，對細胞本身的正常性要求較高，因此，認為胚胎干細胞較 iPS 更具優勢。
上皮細胞主要包括上皮干細胞及其子代短暫擴充細胞、終末分化細胞。其中干細胞存在于上皮基底層，有無限的增殖潛能，正常情況下處于靜止狀態； 短暫擴充細胞具有低的自我更新能力和高的終末分化可能性，短暫擴充細胞僅分裂增殖 3 ~5 次即到終末分化狀態。
處于不同分化階段的細胞具有不同的表型。β1 整合素（ integrin-β1） 的表達是維持角質形成細胞未分化狀態所需要的，β1 整合素可以區分角質形成細胞干細胞和短暫擴充細胞。Michel 等[14]對 CK19和 β1 整合素進行研究后提出，細胞經染色后，若CK19 和 β1 整合素同時呈陽性且具有未完全分化狀態特征的干細胞，則可視為角質形成細胞的祖細胞。P63 主要與上皮細胞的分化和增殖有關，之前被認為是干細胞標志物，但最近的研究表明，P63 在體內不僅表達于基底層而且還表達于基底上層，即表達于正在增殖的和有增殖能力的細胞[15],因此推斷 P63 更應該是短暫擴充細胞而非干細胞標志物[16 -18].CK18 在細胞進入分化和復層前，持續地在單層細胞中表達，有些細胞 CK18 的表達下調被CK14 取代[19].CK14 早期表達時可作為復層細胞的基底細胞標志物表達于單層細胞上[19].CK10 通常表達于角化復層鱗狀上皮的基底上層，即終末分化時將要角化的細胞，為角化標志，其表達與上皮細胞角化狀態密切相關。低相對分子質量 CK（ AE1）對腺上皮表達敏感性較高，高相對分子質量 CK（ AE3） 對鱗狀上皮表達敏感性較高。
本研究誘導 hESCs 分化而成的 K-hESCs 呈現正常的 46 條女性染色體核型。Real-time PCR 檢測結果表明，在基因水平上，單層上皮干細胞標志物CK18、短暫擴充細胞標志物 p63 的表達呈現先上升后下降的趨勢，復層上皮基底層標志物 CK14 呈現先稍微降低后上升的趨勢，提示 K-hESCs 經歷了由hESCs 向單層上皮干細胞分化繼而轉向復層上皮終末分化發展的趨勢。免疫組織化學染色顯示，K-hESCs 在分化過程中，CK18、P63 表達先上升后下降，CK14 表達增加，與基因水平一致； 此外，單層細胞表皮干細胞標志物 CK19、β1 整合素的表達增高，間充質細胞標志物（ 上皮干細胞標志物） 波形蛋白（ VIM） 及角化標志物 CK1、CK10 的表達增高，可以推斷 P1 代第 7 天時 K-hESCs 正處于角化細胞祖細胞階段，其鱗狀上皮標志物 AE3 的免疫組織化學表達高于腺上皮的標志物 AE1 的表達，提示所得角化細胞祖細胞更偏向于鱗狀上皮細胞的祖細胞。
Real-time PCR 檢測結果顯示，P1 代第 7 天時K-hESCs 上皮干細胞標志物 CK18 的基因表達與 HGECs、HIOECs、HaCaT 相比差異無統計學意義（ P >0. 05） ,而復層上皮細胞基底層標志物 CK14 的表達顯著低于 HGECs、HIOECs、HaCaT（ P < 0. 01） ,提示 P1 代第7 天時 K-hESCs 處于未完全成熟階段。
P1 代第 7 天時 K-hESCs 的 p63 表達與 HGECs 及HIOECs 差異無統計學意義（ P > 0. 05） ,而與 HaCaT有明顯差異 （ P < 0. 01） ,提示 P1 代第 7 天時K-hESCs可能更偏向于將來分化為口腔黏膜上皮。
綜上，本研究可在體外有效誘導 hESCs 分化為上皮樣角質形成細胞 K-hESCs,誘導所得 P1 代第 7天時的 K-hESCs 具有正常核型，類似于單層鱗狀上皮干細胞向終末分化初始階段的角質形成細胞，該階段細胞由上皮干細胞靜止狀態被激活，處于分化初始高增殖活力階段，有望作為口腔臨床藥物的毒理檢測模型。
參考文獻
[1] Rolletschek A,Blyszczuk P,Wobus AM. Embryonic stem cell-derived cardiac,neuronal and pancreatic cells as model systems tostudy toxicological effects[J]. Toxicol Lett,2004,149 （ 1 - 3 ） :361 - 369.
[2] Amit M,Carpenter MK,Inokuma MS,et al. Clonally derived hu-man embryonic stem cell lines maintain pluripotency and prolifera-tive potential for prolonged periods of culture[J]. Dev Biol,2000,227（ 2） : 271 - 278.
[3] Thomson JA,Itskovitz-Eldor J,Shapiro SS,et al. Embryonic stemcell lines derived from human blastocysts[J]. Science,1998,282（ 5391） : 1145 -1147.
[4] Laustriat D,Gide J,Peschanski M. Human pluripotent stem cellsin drug discovery and predictive toxicology[J]. Biochem SocTrans,2010,38（ 4） : 1051 - 1057.
[5] Iuchi S,Dabelsteen S,Easley K,et al. Immortalized keratinocytelines derived from human embryonic stem cells[J]. Proc NatlAcad Sci U S A,2006,103（ 6） : 1792 - 1797.
[6] Metallo CM,Ji L,de Pablo JJ,et al. Retinoic acid and bone mor-phogenetic protein signaling synergize to efficiently direct epithelialdifferentiation of human embryonic stem cells[J]. Stem Cells,2008,26（ 2） : 372 - 380.
[7] 張志愿，帕提曼·司地克，曹俊，等。 16 型人乳頭狀瘤病毒 E6、E7 誘導的人永生化口腔上皮細胞系的建立[J]. 中華口腔醫學雜志，2002,37（ 1） : 12 -14.
