卵泡是卵巢內的基本功能單位，包含一個卵母細胞、顆粒細胞及膜細胞〔1〕。卵泡膜間質細胞 \\( theca －interstitial cells，TIC\\) 是卵巢中除卵泡外具有分泌雄激素功能的間質細胞，它在卵泡的生長發育、閉鎖過程中發揮著多種重要作用〔2 －4〕，同時作為卵巢微環境的主體成分之一，TIC 參與了卵巢衰老〔5〕及多囊卵巢綜合征等卵巢相關疾病〔6〕的發生發展。為了能夠進一步深入研究 TIC 對卵巢功能的影響及其作用機制，在體外構建一個可最大程度模擬體內環境下卵泡與TIC 相互關系的共培養模型是十分有意義的。目前卵泡的培養主要包括二維法和三維法，而共培養方法包括直接接觸式和非直接接觸式。本研究擬采用海藻酸鈉凝膠 \\( alginate hydrogel，ALG\\) 和 Transwell 構建 3種共培養模型，從卵泡的形態觀察、生長發育、存活率、激素分泌水平和減數分裂恢復情況等方面進行綜合評價，旨在探索一種最佳的共培養方法。

1 材料和方法

1. 1 實驗動物 由武漢大學動物實驗中心提供 SPF級 C57BL/6 小鼠，動物處理過程遵守動物保護與使用原則，并獲華中科技大學同濟醫學院動物保護委員會批準。

1. 2 主要試劑 Lebovitz＇s L －15 培養基\\( Invitrogen\\) 、－MEM 培養基 \\( Hyclone\\) 、注射用重組人促卵泡激素\\( Merck serono\\) 、FBS\\( Gibco\\) 及 hCG\\( 赤峰博恩藥業有限公司\\) ，其他試劑均購自 sigma 公司。

1. 3 卵泡膜間質細胞的分離與培養 分離 21 ～ 25 日齡 C57BL/6 雌鼠的卵巢，針刺以盡量多地釋放出卵泡中的顆粒細胞。將殘余組織充分剪碎后用消化液\\( McCoy＇s 5a 培養基 +4 mg/ml 膠原酶Ⅳ +10%胎牛血清\\) 37℃消化 1 h，每 15 min 吹打 1 次。將消化好的細胞 懸 液 進 行 離 心 \\( 1 000 rpm，5 min\\) ，并 用McCoy＇s 5a 培養基清洗 1 次。最后所得的細胞用 TIC 培養基 \\( McCoy＇s 5a 培養基 +10% 胎牛血清 +100 IU/ml青霉素 + 0. 1 mg/ml 鏈霉素\\) 重懸，接種于 24 孔板或 Transwell 濾膜 \\( Corning，#3422\\) 底側面 \\( 倒置于 12 孔板中\\) ，每孔細胞數約為 1 × 105個，置于37℃ 、95% O2～ 5% CO2培養箱中培養 24 h，細胞貼壁后將 Tranwell 按正常位置置于24 孔板中，加入 TIC培養基。

1. 4 竇前卵泡的分離 用 29 號胰島素針針頭針刺14 ～ 16 日齡 C57BL /6 雌鼠的卵巢，分離得到竇前卵泡，置于維持液 \\( －MEM 培養基 +1%FBS +100 IU/ml青霉素 + 0. 1 mg/ml 鏈霉素\\) 中，37℃、95% O2～5% CO2培養箱中孵育 30 min。選擇具備以下特征的健康卵泡用以下一步包埋或培養: ①直徑在110 ～140 μm之間; ②具有完整連續的基底膜，無明顯因操作造成的卵泡損傷; ③卵泡中央可見一個未成熟的卵母細胞; ④無明顯竇腔形成。

1. 5 卵泡與卵泡膜間質細胞的共培養

1. 5. 1 海藻酸鈉凝膠法 將卵泡膜間質細胞接種于 24孔板底部，孵育過夜，更換卵泡生長培養基 \\( － MEM培養基 + 10%FBS +ITS +10 mIU/ml FSH +100 IU/ml 青霉素 + 0. 1 mg/ml 鏈霉素\\) ，600 l/孔。將 5 個竇前卵泡轉移至 2% \\( w/v\\) 無菌海藻酸鈉液珠中，充分浸入包埋液 \\( 50 mM CaCl2+ 140 mM NaCl\\) 中交聯2 min形成凝膠，再將海藻酸鈉膠珠置入 24 孔板內，記為共培養第零天。

1. 5. 2 Transwell 間接接觸法 將卵泡膜間質細胞接種于 24 孔板底部，更換 500 μl 卵泡生長培養基，放入 Transwell 小室，加入 100 μl 卵泡生長培養基，直接吸取 5 個卵泡轉移至上室內。

1. 5. 3 Transwell 直接接觸法 將培養于 Transwell 小室底側面的卵泡膜間質細胞置于 500 μl 卵泡生長培養基中，直接吸取 5 個卵泡轉移至含 100 μl 卵泡生長培養基的上室內。

1. 5. 4 培養基更換 每組包含 20 ～ 30 個卵泡，于37℃ 、95% O2～ 5% CO2培養箱中培養 6 天，隔天半量更換新鮮配制的卵泡生長培養基，收集培養基凍存于 －80℃，用于激素檢測。

1. 6 評價方法

1. 6. 1 卵泡形態、直徑、存活率監測〔7〕: 從第 1 天開始，隔天用倒置相差顯微鏡觀察卵泡形態并拍照，用 ImageJ 軟件測量卵泡直徑 \\( 取長軸和短軸的平均值\\) 。通過觀察卵泡形態判斷是否存活，將具有以下特征的卵泡視為死亡卵泡: ①卵泡或卵母細胞碎裂、皺縮，尺寸縮減; ②卵母細胞不再由顆粒細胞層包繞; ③顆粒細胞變暗或碎裂。

1. 6. 2 激素分析 收集共培養第 2、4、6 天 1 /2 的培養基凍存于 －80℃冰箱，用直接化學發光法測定睪酮、雌二醇。

1. 6. 3 卵母細胞的減數分裂能力評價〔7 －8〕: 培養結束后，用含 10IU/ml 海藻酸鈉裂解酶的 － MEM 培養基替換原有的培養基，在 37℃、95% O2～ 5% CO2培養箱中孵育30 min。將卵泡從裂解的海藻酸鈉凝膠中轉移至成熟培養基 \\( maturation medium: － MEM 培養基 + 10% FBS + 5 ng/ml EGF + 1. 5 IU/ml hCG +100 IU / ml青霉素 + 0. 1 mg / ml 鏈霉素\\) 中，在 37℃ 、95% O2～ 5% CO2培養箱中孵育 16 ～20 h，進行體外成熟 \\( IVM，in vitro maturation\\) 。然后用 0. 3% 透明質酸酶處理卵泡，并用吸管輕輕吹打，使卵母細胞從卵泡中裸露出來。觀察卵母細胞并按以下方法進行分類: ①生發泡期 \\( GV，germinal vesicle\\) : 卵母細胞在 hCG 的作用下未恢復減數分裂，可見卵母細胞的細胞核持續存在; ②生發泡破裂期\\( GVBD\\) : 卵母細胞核膜消失，生發泡不可見; ③減數第二次分裂期\\( MII，metaphase II\\) : 卵母細胞恢復減數分裂，停滯在減數第二次分裂期，在卵母細胞周圍可見第一極體; ④退化\\( DG，degenerated\\) : 卵母細胞碎裂或皺縮。

1. 7 統計分析 所有實驗均獨立重復 5 遍以上，運用 SPSS 18. 0 統計軟件進行數據處理與分析，計量資料采用 \\( x ± s\\) 表示，卵泡直徑、激素水平的組間比較采用單因素方差分析 \\( ANOVA\\) ，卵泡存活率和減數分裂階段采用 χ2檢驗，P ＜ 0. 05 表示有統計學差異。

2 結果

2. 1 3 種共培養方法下卵泡的生長發育 海藻酸鈉凝膠包埋的卵泡在體外培養的 6 天中始終維持了卵泡的三維結構，并可以清晰觀察到卵母細胞、顆粒細胞和卵泡膜細胞 \\( 圖 1A － C\\) 。培養結束時可以觀察到處于偏心位置的卵母細胞，部分卵泡的卵母細胞周圍可見竇腔形成，而在 Transwell 中培養的兩組，鏡下觀察到卵泡結構較不清晰，顆粒細胞與卵泡膜細胞的分界不清，在培養到第 3 天開始，卵泡內的顆粒細胞開始貼壁生長，卵泡直徑急速增加，培養到第 5 天時，部分卵泡的顆粒細胞向外擴散增殖，導致卵泡結構的破壞，而這種現象在海藻酸鈉凝膠法中的發生率很低。在 3 種共培養方法中，卵泡的生長發育均呈現出兩個階段 \\( 圖 2\\) : 培養第 5 天前，卵泡生長緩慢，之后卵泡則開始加速生長。在起始卵泡直徑控制在110 ～ 140 μm 的前提下，在培養的第 1 天、第 3 天各組間卵泡直徑均無統計學差異 \\( P ＞ 0. 05\\) ，卵泡存活率也無統計學差異 \\( 分別 為 91. 1%、89. 1%、88. 2% \\) ，見表 1。在培養到第 5 天時，海藻酸鈉凝膠法的卵泡生長加速幅度明顯低于 Transwell 內的兩組，使得三維培養的卵泡直徑小于 Transwell 內的卵泡 \\( 180. 3 ± 39. 6\\) 、 \\( 209. 4 ± 59. 3\\) 、 \\( 226. 4 ±62. 6\\) μm，P ＜ 0. 05，而 Transwell 直接接觸法和間接接觸法之間無統計學差異。第 5 天的卵泡存活率也出現差異，海藻酸鈉凝膠法 \\( 77. 3%\\) 和 Transwell直接接觸法 \\( 76. 5%\\) 要高于 Transwell 間接接觸法\\( 57. 4%\\) ，P ＜0. 05，海藻酸鈉凝膠法和 Transwell 直接接觸法之間無統計學差異?！颈?】

2. 2 激素分泌 3 種共培養方法中，睪酮的分泌水平在第 2、4、6 天均逐漸升高，且各組間無明顯差異\\( 圖 3\\) ，而雌二醇水平在 3 組中的分泌情況與相應卵泡的直徑增長情況相一致。第 2 天和第 4 天，3 組間均無統計學差異，但到第 6 天，Transwell 間接接觸法\\( 2 752. 4 ±341. 6\\) pg/ml 和 Transwell 直接接觸法 \\( 2651. 0 ± 318. 9\\) pg / ml 中雌二醇的分泌量明顯高于海藻酸鈉凝膠法 \\( 1 097. 6 ± 34. 0\\) pg/ml，P ＜ 0. 001，Transwell 間接接觸法和 Transwell 直接接觸法之間無統計學差異。2. 3 體外成熟 \\( IVM\\) 后卵母細胞減數分裂恢復情況 在體外培養 6 天后，選擇鏡下觀察形態完整的存活卵泡進行體外成熟。在海藻酸鈉凝膠法中 66. 7%的卵母細胞能夠恢復減數第一次分裂，其中 17. 3%能夠排出第一極體恢復減數第二次分裂，而 Transwell間接接觸法和 Transwell 直接接觸法的 GVBD 率分別為64. 2%、66. 7%，MII 率分別為 14. 0%、6. 0%。3組間在 GV、GVBD、MII、DG 的比例上均無統計學差異，見表 2?！颈?】

3 討論

海藻酸鈉凝膠是近年來應用比較廣泛的卵泡三維培養材料，在小鼠模型中可成功培養出活的、健康的、并能產生后代的卵泡，卵泡和卵母細胞均能生長達到與在體發育相似的直徑〔9〕，而且顆粒細胞可進行增殖，分泌雌二醇、孕酮、雄烯二酮至周圍培養基中。通過共培養方法，能夠將卵泡體外培養的起始階段提前至早期次級卵泡，甚至初級卵泡。如與胚胎成纖維細胞 \\( MEFs\\)〔7〕進行共培養，這種常用于促進胚胎干細胞未分化生長的飼養細胞能夠提供卵泡存活和生長所必需的關鍵旁分泌因子，從而使得早期次級卵泡 \\( 平均直徑為 90 ～100 μm\\) 和初級卵泡 \\( 平均直徑為 70 ～80 μm\\) 得以在體外生長至 251 ～347 m，形成竇腔，獲得較高的存活率 \\( 分別為 70% 和23% \\) ，而且大多數的卵泡能夠恢復減數分裂。有學者〔10〕利用卵巢間質細胞 \\( 主要成分為膜細胞和卵巢巨噬細胞\\) 作為飼養細胞，模擬小卵泡在體內的環境，提高雄激素的生成，補充缺乏的細胞因子，顯著促進了初級卵泡和早期次級卵泡的生長和存活。此外，在其他物種中，如水牛的大竇前卵泡與多種卵巢體細胞 \\( 如卵丘細胞、顆粒細胞、卵巢間充質細胞、輸卵管上皮細胞\\) 進行直接共培養也獲得了成功〔11〕。

Transwell 小室是一種多用途的帶有多微孔膜的通透性支持物，可以允許細胞從其基底面和頂面分泌和吸收分子，使得細胞可以在更為自然的極性條件下生長，同時還提高了細胞的分化水平，使得體外生長的細胞在形態和功能上更為接近體內的細胞。Eppig 等人〔12〕用兩步法體外培養始基卵泡，先將卵巢組織培養于核孔聚碳酸酯膜上，然后將卵母細胞 － 顆粒細胞復合物轉移至 Transwell － COL 膜上培養，其中發生GVBD 的卵母細胞比例提高了 15% ～ 30% 。NayuduPL 等人〔13〕將小鼠竇前卵泡 \\( 150 μm\\) 培養于 Millli-cell 膜上，在 FSH 的作用下，經過 6 ～ 7 天的培養，卵泡能夠生長至大竇狀卵泡 \\( 直徑 400 ～ 500 μm\\) ，并可高分泌雌激素。采用 Transwell 構建的間接接觸和直接接觸的共培養模型，便于對兩種細胞類型分別進行觀察和處理，可以更有效地進行現象和機制的研究。其中間接接觸法中兩種細胞被間隔于兩個腔室中，沒有直接的接觸，而直接接觸法模擬體外血腦屏障模型〔14〕將共培養細胞接種于多孔濾膜的上下兩側，則可以使兩種細胞得到一定程度的接觸，可能更接近于體內卵泡和卵泡膜間質細胞間的相互作用模式。

在本研究中，海藻酸鈉凝膠組的卵泡在體外培養階段始終維持其三維結構，并且能夠清晰辨認卵母細胞、顆粒細胞、基底膜及其周圍的卵泡膜細胞，而Transwell 中培養的卵泡由于底層多微孔膜的影響，結構觀察不清，而 3 種方法的卵泡在體外的生長發育都經歷了緩慢生長期和加速生長期，這與 Mousset 等人〔15〕的研究中觀察到的現象一致。經過體外 6 天的培養，3 組卵泡直徑均增長至 180 ～230 m，與 Xu 等人〔16〕報道的培養至第 8 天時的卵泡直徑相近，提示通過共培養可能促進了卵泡的生長。在卵泡培養的前3 天，各組間卵泡直徑的增長幅度無統計學差異，但到第 5 天，Transwell 間接組和直接組卵泡直徑明顯大于海藻酸鈉凝膠組，這可能與 Transwell 中卵泡呈二維式的平面生長，而海藻酸鈉凝膠中卵泡維持三維立體生長，從而在鏡下觀察到的二維圖像上顯示了較小的直徑有關，另一方面可能由于在 Transwell 聚碳酯膜上貼壁生長的顆粒細胞易于增殖，而海藻酸鈉凝膠的硬度也在一定程度上限制了卵泡的生長。

卵泡存活率在體外培養第 5 天也出現差異，海藻酸鈉組 \\( 77. 3%\\) 和 Transwell 直接組 \\( 76. 5%\\) 要高于 Transwell 間接組 \\( 57. 4%\\) ，P ＜ 0. 05，提示卵泡三維結構的維持以及卵泡與卵泡膜間質細胞的直接接觸可能有利于卵泡的存活。這與近些年的研究結果相一致，維持卵泡細胞與卵母細胞之間的相互作用，如縫隙連接、旁分泌效應，是卵泡發育的關鍵所在〔17〕。

睪酮的分泌水平主要反映了卵泡膜間質細胞的功能，而雌激素合成則是卵泡的重要功能之一。在本研究中睪酮水平隨著培養時間的延長逐漸升高，且在各個時間點 \\( 第 2、4、6 天\\) 各組間均無統計學差異，說明 3 種共培養方法下卵泡膜間質細胞均能正常增殖和分化。雌二醇的水平也隨著培養時間的延長逐漸升高，同時在第 6 天顯現出差異，海藻酸鈉凝膠法明顯低于其他兩種方法，這與相應的卵泡直徑變化相一致。這種差異提示海藻酸鈉凝膠法的卵泡和卵泡膜間質細胞之間的相互作用較 Transwell 中有所不同，可能主要體現在除睪酮外的其他激素分泌和一些旁分泌因子的差異上，如卵泡膜間質細胞能夠產生 ckit 蛋白、BMP4、Smad3、TGF 、角 化 細 胞 生 長 因 子\\( KGF\\) 、肝細胞生長因子 \\( HGF\\) 等，其中 ckit 蛋白能促進始基卵泡向初級卵泡發育和生殖細胞的遷移、增殖，BMP4 可促進始基卵泡向初級卵泡發育和卵母細胞的存活，KGF 能促進顆粒細胞的增殖〔18〕。

此外，3 種共方法均能產生具備完整減數分裂能力的卵母細胞。

通過對卵泡的形態觀察、生長發育、存活率、激素分泌和卵母細胞減數分裂恢復能力方面的評價，海藻酸鈉凝膠法具備便于觀察、維持卵泡三維結構等優點，但卵泡的包埋和釋放過程較為繁瑣，且增加了對卵泡造成損傷的概率。同時，Transwell 直接接觸法具有操作簡便的優點，但不利于卵泡結構的維持，相應的成本較高，觀察不夠清晰。因此，建議短期 \\( 5 天內\\) 的體外培養可以選擇操作更簡便的 Transwell 直接接觸法，而長期培養則推薦能夠維持卵泡三維結構的海藻酸鈉凝膠法。