內皮細胞衰老引起的內皮細胞功能減退是心腦血管疾病隨年齡增加的主要因素之一[1-2].氧化應激是導致細胞衰老的主要原因之一。隨著年齡的增加，內皮細胞活性氧（ reactive oxygen species,ROS）的產生增多、清除減少，導致其在內皮細胞內積聚，并最終導致內皮細胞衰老、損傷及功能失調[3].
Sirtuins 家族是一類依賴煙堿胺腺嘌呤二核苷酸（ NAD） 的組蛋白去乙?；?，Sirt3 是 Sirtuins 家族的成員[4].研究表明，Sirt3 可通過去乙?；嚓P蛋白，抑制線粒體內 ROS 的蓄積[5].提示 Sirt3 可通過抑制血管內皮細胞線粒體內 ROS 的蓄積，抑制血管內皮細胞的衰老過程。本研究通過 Sirt3-siRNA抑制 Sirt3 蛋白的表達，觀察人臍靜脈內皮細胞（ hu-man umbilical vein endothelial cells,HUVECs ） β-gal陽性染色率、細胞衰老相關蛋白 P16 及 P21 的表達、ROS 蓄積水平，旨在探討 Sirt3 對 HUVECs 衰老的影響及其可能的機制。
1 材料與方法
1. 1 材料
1. 1. 1 實驗細胞 HUVECs,購自美國 ATCC 公司。
1. 1. 2 主要試劑 ECM 培養基購自美國 Sciencell公司； 胰蛋白酶、DCFH-DA 均購自美國 Sigma 公司； Sirt3-siRNA 序列由上海吉瑪生物制藥有限公司合成； 脂質體 LipofectamineTM2000 購自美國 Inven-trogen 公司； Opti-MEM 購自美國 Gibco 公司； β-半乳糖苷酶染色試劑盒、免疫印跡試劑盒和 BCA 蛋白定量試劑盒均購自上海碧云天生物科技有限公司；兔來源 Sirt3 單克隆抗體、小鼠來源 P16 單克隆抗體、兔來源 P21 單克隆抗體均購自美國 Santa CruzBiotechnology 公司； 兔來源 β-actin 單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠 IgG 均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 HUVECs 的培養與分組 將復蘇后的HUVECs接種于 ECM 培養基中，置于 37 ℃ 、5% CO2細胞孵育箱中常規培養。取 3 ~7 代 HUVECs 種板并行同步化處理，并將細胞分為對照組和 Sirt3-siRNA 組。
1. 2. 2 Sirt3-siRNA 轉染 HUVECs 及抑制序列的篩選 用不含抗生素的培養基接種細胞于 6 孔板中，置于 37 ℃、5% CO2培養箱中培養 24 h,轉染時細胞的融合度達到 50%左右。實驗分為對照組、抑制序列 1 組、抑制序列 2 組、抑制序列 3 組。各抑制序列均根據 Sirt3 mRNA 序列以化學合成法設計合成。3 條抑制序列分別為： 抑制序列 1,Sirt3-homo-340;抑制 序 列 2,Sirt3-homo-752; 抑 制 序 列 3,Sirt3-homo-1613.轉染方法按 LipofectamineTM2000 說明書操作。轉染 48 h 后提取細胞總蛋白，用 Westernblotting 法篩選出抑制效率最高的一組抑制序列。
1. 2. 3 Western blotting 法檢測細胞中 Sirt3、P16 及P21 的蛋白表達 應用細胞裂解液（ RIPA 與 PMSF按 100∶1 配制） 充分裂解細胞，提取各組 HUVECs總蛋白，用 BCA 蛋白定量試劑盒測定各樣品蛋白濃度，并調整各樣品上樣量為 40 μg,行 8% ~ 12%SDS-PAGE 凝膠電泳后轉到 PVDF 膜上。5% 的脫脂奶粉室溫封閉 2 h 后，分別加入兔抗 Sirt3、鼠抗P16、兔抗 P21 和兔抗 β-actin 抗體 4 ℃ 搖床過夜。第 2 天用 1 × TBST 洗膜后，在辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或山羊抗鼠 IgG 中室溫孵育 1 h,1 ×TBST 洗滌后進行暗室曝光顯影。Image J 軟件測量相對灰度值。
1. 2. 4 β-半乳糖苷酶染色法檢測 HUVECs 的衰老具體步驟根據試劑盒說明操作。待 Sirt3-siRNA刺激細胞 48 h 后，棄去 6 孔板中的原培養基，用PBS 沖洗 3 遍后，加入 4% 的多聚甲醛固定 20 min.再用 PBS 沖洗 3 遍后，加入 2 mL 染色工作液 37 ℃孵育過夜。普通光學顯微鏡下觀察。
1. 2. 5 DCFH-DA 法測定 HUVECs 內 ROS 水平待 Sirt3-siRNA 刺激細胞48 h 后，棄去6 孔板中的原培養基，用 PBS 沖洗 2 遍后，加入含終濃度為 10 μmolDCFH-DA 的無血清培養基 1 mL.37 ℃ 、5% CO2細胞孵育箱中孵育 20 min 后，用無血清培養基沖洗3 遍，于激光共聚焦顯微鏡下觀察 ROS 熒光強度并拍照。
1. 3 統計學處理 采用 GraphPad Prism 6 軟件，所有數據均以 x珋 ± s 表示，對照組與 3 個抑制序列組比較采用單因素方差分析； Sirt3-siRNA 組與對照組比較采用 t 檢驗。P <0. 05 為差異有統計學意義。
2 結 果
2. 1 Sirt3-siRNA 抑制序列的篩選 見圖 1.3 組抑制序列中，抑制序列 1 的 Sirt3 蛋白表達量最低，且明顯低于對照組，所以抑制序列 1 抑制效率最高，故選擇序列 1 進行后續實驗。
2. 2 Sirt3-siRNA 對衰老相關基因 P16 和 P21 蛋白表達的影響 見圖 2.結果顯示與對照組相比，Sirt3-siRNA 組 Sirt3 蛋白表達明顯減少，P16 和 P21蛋白表達水平明顯升高（ P <0. 05） .
2. 3 HUVECs β-半乳糖苷酶染色 見圖 3.結果顯示，Sirt3-siRNA 組 β-半乳糖苷酶染色陽性率明顯高于對照組。
2. 4 HUVECs 內 ROS 水平 見圖 4.結果顯示，與 對照組相比，Sirt3-siRNA 組細胞內 ROS 水平升高。
3 討 論
研究表明，衰老是心腦血管疾病的獨立危險因素，如高血壓、冠心病、腦卒中等的發病率隨著年齡的增長而急劇上升。因此研究血管內皮細胞衰老發生的機制有助于改善血管內皮細胞功能，以預防和延緩心腦血管疾病的發生發展。
Sirtuin 家族中成員有 7 個： Sirt1 ~ Sirt7,其在細胞內分布廣泛、功能多樣。研究表明，Sirtuins 家族成員有抗衰老的作用，可延緩衰老相關的心臟疾病[6]、癌癥[7-8]等發生發展。Sirt3 的激活被證實與延長人類壽命相關，其組織器官分布廣泛，在代謝活動活躍的組織如肌肉、肝臟、心臟、棕色脂肪組織中高表達[4].細胞衰老過程是通過信號轉導通路來實現的，其中，端粒酶非依賴的 P16INK4a-Rb 途徑和端粒酶依賴的 P19Arf-P53-P21Cipl 途徑是兩條關鍵的衰老信號轉導通路，其中任何一條通路的激活都可誘導衰老[9].因此 P16 和 P21 是調控細胞衰老的關鍵基因，P16 和 P21 的表達升高可導致早衰。
本研究結果顯示，Sirt3-siRNA 抑制 Sirt3 的表達后，HUVECs 中細胞衰老相關蛋白 P16、P21 及細胞β-半乳糖苷酶染色陽性率均顯著增高。提示，Sirt3-siRNA 抑制 Sirt3 的蛋白表達后，促進了 HUVECs的衰老過程。
氧化應激是目前公認的誘導細胞衰老的主要因素之一[10].線粒體是 ROS 產生的主要場所，Sirt3主要定位于細胞線粒體中。研究發現，Sirt3 可以通過去 乙 酰 化 Foxo3a 提 高 錳 超 氧 化 物 歧 化 酶（ Mn-SOD） 及過氧化氫酶（ CAT） 的表達，從而提高細胞內 ROS 清除能力[11-12].另外，Sirt3 能夠通過去乙?；せ铋L鏈?；o酶 A 脫氫酶（ LCAD） 、琥珀酸脫氫酶 （ Sdh） 、異檸檬酸脫氫酶 2 （ Idh2） 、NADH 脫氫酶等關鍵酶[13-16],增強線粒體氧化呼吸作用，從而減少了 ROS 的生成。本實驗結果顯示，Sirt3-siRNA 抑制 HUVECs Sirt3 蛋白表達后，HUVECs內的 ROS 水平明顯降低。Sirtuin 家族另一成員Sirt1 也被發現可預防氧化應激誘導的HUVECs早衰的發展[17].
綜上所述，我們認為，Sirt3 可通過減少細胞中ROS 的蓄積來延緩 HUVECs 的衰老進程。
參考文獻：
[1] Paneni F,Costantino S,Cosentino F. Molecular path-ways of arterial aging[J]. Clin Sci （ Lond） ,2015,128（ 2） : 69-79.
[2]Wang M,Jiang L,Monticone RE,et al. Proinflamma-tion: the key to arterial aging[J]. Trends EndocrinolMetab,2014,25（ 2） : 72-79.
[3]Oeseburg H,Iusuf D,van der Harst P,et al. Bradykininprotects against oxidative stress-induced endothelial cellsenescence[J]. Hypertension,2009,53（ 2） : 417-422.
[4]時小燕，杜麗敏。 Sirtuin 家族成員及其生物學特性[J].國際藥學研究雜志，2011,38（ 5） : 349-355.
