椎間盤由髓核、纖維環和軟骨終板 3 部分組成，是人體中最大的無血管組織。 四歲時椎間盤就幾乎沒有任何血管，間盤營養嚴重減少，髓核細胞群隨之發生明顯變化，脊索細胞被更多的能適應無氧環境的軟骨細胞和纖維母細胞所代替； 十歲時頸椎間盤已經成為一個無血管的組織，其營養供應主要來自于軟骨終板的滲透。 軟骨終板中央部分滲透性較周圍部分高。 軟骨終板中央部分有 1/3 區域可以滲透，而周圍部分僅約 1/10 區域可以滲透； 軟骨終板在髓核處溶質滲透占整個軟骨終板的 85%,在軟骨終板接近內呈纖維環處下降到 35%,在軟骨終板接近外層纖維環界面處幾乎完全不能滲透。 椎間盤營養通路主要有終板途徑和纖維環途徑： 椎體內的血管不斷分支，在軟骨終板下骨質形成血管袢，包括氧氣在內的絕大部分營養物質通過這些血管袢經擴散作用透過軟骨終板、椎間盤基質，最終到達內部的椎間盤細胞，而乳酸等代謝廢物經過相反途徑排出，此即終板途徑，Du 等通過動態增強 MRI 清楚觀察到這一現象[1]; 小部分營養物質通過分布到最外層纖維環的血管末梢來提供養分，即纖維環途徑[2 -3]. 但隨著機體的老化，供應椎間盤周圍的血管數量減少，軟骨終板逐漸鈣化，氧氣等營養物質的供應及代謝廢物的排除受到阻滯，椎間盤內逐漸形成缺氧微環境。 這種微環境對椎間盤退變的發生發展如何產生影響，椎間盤退變是否與缺氧環境有關，這些都成為近年來學者們研究的重要課題。 骨鈣素是骨轉化的重要指標，能反應骨質疏松的狀況[4]. 最近研究發現骨鈣素參與誘導椎間盤軟骨終板的退變鈣化過程，影響椎間盤退變[5]. 本實驗擬通過體外培養髓核細胞，應用免疫學及組織化學原理，對組織切片或細胞標本中的某些化學成分進行原位的定性、定位或定量研究，判斷缺氧環境是否是骨鈣素（ OCN） 變化的因素。
1 材料與方法
1. 1 主要試劑和儀器
永生化人髓核細胞株（ 上海拜力生物） ,基礎培養箱，HF100 三氣培養箱，骨鈣素（ OCN） 檢測試劑盒（ 一抗，二抗，中杉金橋公司） ,磷酸鹽緩沖液（ PBS） ,4% 多聚甲醛試劑，曲拉通 X-100,H2O2溶液，牛血清白蛋白（ BSA） ,DAB 顯色試劑盒，CKX31-A12PHP 倒置顯微鏡（ Olympus 公司） .
1. 2 免疫細胞化學染色檢測髓核細胞常氧與需氧下 OCN 表達，采用免疫組織化學 SABC 法
制作髓核細胞爬片，于 37℃常氧培養箱，和模仿椎間盤缺氧（ 3% O2） 條件的培養箱中培養； 于規定時間節點取出細胞爬片，PBS 緩慢洗滌 3 次，每次 5 min,室溫干燥； 4% 多聚甲醛固定 20 min,PBS 緩慢洗滌 3 次，每次 5 min; 3%Triton-100 處理 20 min,PBS 緩慢洗滌 3 次，每次 5 min; 3%H2O2處理 15 min,PBS 緩慢洗滌 3 次，每次 5 min; 山羊血清或者 BSA 封閉 2 h,PBS 緩慢洗滌 3 次，每次 5 min; 一抗（ 兔抗人 OCN 單抗（ 1∶ 200） ） 4℃ 過夜封閉； 將玻片從 4℃ 取出，室溫復溫 30 min,PBS 緩慢洗滌 3 次，每次5 min; 室溫孵育二抗（ 生物素標記的羊抗兔 IgG 抗體） ,結合 2 h,PBS 緩慢洗滌 3 次，每次 5 min; 三抗（ SABC） 封閉，室溫下結合 2 h,PBS 緩慢洗滌 3 次，每次 5 min; DAB 顯色 3 ~10 min,待細胞出現特異性染色后用水洗滌，鏡檢； 鹽酸乙醇分化，氨水反藍，鏡檢； 脫水，封閉； 拍攝，細胞核均染為藍色，OCN 表達陽性細胞胞質均染為棕色。
1. 3 免疫組化圖像分析
用 Image-Pro Plus（ IPP） 6. 0 分析免疫組化圖片，根據染色染料顏色的深淺（ 光密度） 及分布面積大小來確定目標蛋白的量。 染色區域分布面積與目標蛋白量成正比。 染色的顏色深淺（ 光密度） 與目標蛋白量的定量關系符合朗伯-比爾定律，是對數關系。 每張切片在高倍鏡下（ ×100） 隨機選取 8 個視野，應用圖像分析系統進行半定量檢測，結果以平均灰度值表示。 平均灰度值高（ 染色強度弱、透光度強） 表示OCN 表達水平低； 反之則表示表達水平高。 平均光密度 OD 值（ 吸收光的物質的光學密度，與染色物質的量相關） 高，表示 OCN 表達水平高； 反之則表示表達水平低。 將圖片上各點的光密度值累加起來，得到IOD. 此值與目標物質的總量成正比。 IOD 值除以細胞個數，得到單個細胞的 mean density,此值反映了單個細胞 OCN 表達的水平。
1. 4 統計學處理
應用 SPSS 19. 0 統計學軟件進行數據處理。 檢測數據以 m ± s 表示，組間比較采用單因素方差分析Tamhane's T2檢驗，以 P <0. 01 為差異有統計學意義。
2 結 果
2. 1 生長曲線分析
檢測結果見圖 1 ~2 在培養 48、72 h 時，缺氧組髓核細胞較常氧組細胞增殖速度減緩 >40%.
2. 2 常氧與需氧環境中髓核細胞 OCN 的表達髓核細胞 OCN 的表達檢測結果見圖 3 ~4 和表 1.
缺氧組與常氧組均可見 OCN 表達陽性細胞，且與常氧組比較，缺氧組多數陽性細胞的細胞質染色較深。 在培養 24 h 時，缺氧組髓核細胞 OCN 表達水平與常氧組比較，差異無統計學意義。 在培養48、72 h 時，缺氧組髓核細胞 OCN 表達水平均明顯高于常氧組（ P < 0. 01） ,且缺氧組髓核細胞 OCN表達水平隨缺氧時間延長而逐漸升高（ P <0. 01） ,常氧組各時間段之間髓核細胞 OCN 表達水平無統計學差異。
3 討 論
近年來在椎間盤組織工程及生物學研究方面取得的進展，為椎間盤退行性變的生物學治療提供了較好前景。 大量的研究表明，OCN 參與了椎間盤軟骨終板的退變鈣化過程，OCN 敲除可能抑制軟骨終板的退變鈣化[6]. Idelevich 等研究證實 OCN 過表達能促進血管平滑肌細胞和軟骨細胞株的分化及礦化[7],而 OCN siRNA 能抑制主動脈血管的骨化和礦化[8].
本實驗在體外成功構建了人髓核細胞缺氧模型，通過免疫組織化學方法，對不同缺氧時期 OCN 在體外培養髓核細胞中的表達進行定量檢測，結果顯示在培養 48、72 h 時，缺氧組髓核細胞 OCN 表達水平均明顯高于常氧組（ P <0. 01） ,且缺氧組髓核細胞 OCN 表達水平隨缺氧時間延長而逐漸升高，說明缺氧可誘導髓核細胞 OCN 的表達上調，缺氧環境下髓核細胞的骨鈣素過表達，這個結果也可以間接說明缺氧可能對椎間盤軟骨終板礦化起到促進作用。
本實驗有助于進一步揭示椎間盤退變的病理機制，為椎間盤退變的防治開辟新思路與新途徑。
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