間充質干細胞( mesenchymal stem cells,MSCs) 來源于發育早期的中胚層和外胚層,屬于多能干細胞,不僅有較強的增殖潛能,還能分化成不同來源的細胞,如神經細胞、脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、肝細胞及胰島樣細胞等,可作為理想的種子細胞,用于衰老和病變引起的組織器官的損傷修復。臨床上間充質干細胞在治療多種血液系統疾病、肝硬化、神經系統疾病和自身免疫性疾病等方面具有廣泛的應用前景。國外已有多種間充質干細胞產品獲批上市[1 ~2].近幾年來我國已經加大了對干細胞研究支持力度。本實驗評價國產胎盤間充質干細胞制劑是否可引起溶血和紅細胞聚集,以便為其在臨床上應用提供一定的科學依據。
材料與方法
1 材料
間充質干細胞 人胎盤間充質干細胞,胎盤來源于自愿捐獻者。經產婦及其家人簽署知情同意書。
動物 日本大耳白兔,雄性,1 只,普通級,體重2. 54 kg,購自北京隆安實驗動物養殖中心。動物使用許可證號: SYXK( 津) 2011 -0005.
試劑 胎盤間充質干細胞制劑順昊細胞生物技術有限公司制備。RPMI - 1640 培養基、DMEM - F -12 培養基,均為美國 Hyclone 公司生產; 10% 胎牛血清,蘭州百靈生物科技有限公司生產; 淋巴細胞分離液,天津市灝洋生物制品科技有限公司生產。
儀器 Facsealibur 流式細胞儀,美國 BD 公司產品; 5424 離心機,德國 Eppendorf 公司產品; Ckx22 顯微鏡,日本 Olympus 有限公司產品; Lxj - IIb 低速臺式離心機,上海安亭科學儀器有限公司產品; VarioskanFlash 酶標儀,美國 Thermo 公司產品。
2 間充質干細胞的分離提取和擴增
提取分離: 無菌獲取胎盤,立即浸入含 RPMI -1640 培養基、10% 胎牛血清及 1% 青 - 鏈霉素的組織保護液中,分離提取。剪取胎盤絨毛膜面 1 ~2 cm 厚的組織,剪成 1 mm ×1 mm ×1 mm 的碎塊,用 PBS 漂洗至無色,用膠原酶 37 ℃水平搖床震蕩 3 h,懸液用100 μm 細胞篩過濾,上清以 2000 r · min- 1離心 10min,棄上清,所得沉淀即為間充質干細胞。
擴增: 在沉淀細胞中,加入適量培養液混勻,轉入T - 75培養瓶中,以 37 ℃ 、5% CO2培養箱中培養。細胞生長至 80% 時,進行胰酶消化傳代。傳代時,以0. 25% 胰蛋白酶 - EDTA 消化 3 ~ 4 min,加血清終止消化; 以 1500 r·min- 1離心 5 min,棄消化液,加入細胞培養液,吹打混勻,收集細胞懸液,接種于細胞培養瓶,置于 37 ℃、5%CO2培養箱中培養。
3 間充質干細胞樣品的制備
將間充質干細胞重懸于含有 1%人血白蛋白的復方 電 解 質 注 射 液 中,制 備 濃 度 為 5. 0 × 105cells·mL- 1.將含有 1% 人血白蛋白的復方電解質溶液作為空白對照。陰性對照為 0. 9% 氯化鈉注射液。陽性對照為去離子水。
4 溶血實驗操作[3]家兔麻醉后,經心臟取血 10 mL,用玻璃珠除去纖維蛋白,用 0. 9%氯化鈉注射液反復清洗紅細胞 3 次,至上清呈無色透明,棄上清,用 0. 9%氯化鈉注射液稀釋成 2%的紅血球混懸液。
取試管24 支,均分為 2 組并進行編號,其中每組1 ~ 5管為間充質干細胞制劑管,第 6 ~ 10 管為空白對照管,第11 管為陰性對照管,第 12 管陽性對照管。第 2組試管為第1 組試管的復管。參照表1 進行加樣。
用直接觀察和酶標儀比色結合的方法,進行溶血實驗。直接觀察各管在 15,30,45 min 和 1,2,3 h 是否出現溶血和紅細胞凝聚現象。酶標儀測定結果以光密度( A) 表示,并計算各實驗管溶血率。如果受試藥試管中溶液的溶血率小于 5%,則表示無溶血。
結 果
1 直接觀察
1. 1 第 1 組試管
陰性對照管( 11 號) : 加樣后15 ~45 min,管中液體呈鮮紅色渾濁; 加樣后 1 h,少量上清液無色澄明,下層液體呈鮮紅色渾濁,少量紅細胞沉于管底; 加樣后 2 h,管底部逐漸出現深紅色沉淀,頂部上清液無色澄清且逐漸增多。孵育3 h,自培養箱取出試管,振搖后,見管底沉淀均勻分散,無紅細胞凝聚發生。以 2000 r·min- 1離心后,見試管底部有少量沉淀,上清液呈無色澄清。
直接觀察所見,陰性對照管未發生溶血,見表1.
陽性對照管( 12 號) : 自加樣 15 min 至 3 h,管中液體呈澄明鮮紅色,除管底部逐漸出現少量沉淀外,無其他明顯變化。孵育 3 h,振搖,見管底沉淀均勻分散,無紅細胞凝聚發生。離心后,見試管底部有少量沉淀,上清液呈澄明鮮紅色。直接觀察所見,陽性對照管發生了溶血,見表 1.
間充質干細胞制劑管( 1 ~ 5 號) 和空白對照管( 6 ~10 號) 的變化,與陰性對照組變化相同,即直接觀察所見,均未發生溶血,見表 1.
1. 2 第 2 組試管( 復管)
用肉眼對各管與第 1 組試管的直接觀察發現,結果完全一致。
2 經酶標儀測得結果
測定結果見圖 1.
由圖 1 可見,間充質干細胞制劑及間充質干細胞制劑空白對照各管的溶血率均低于 5%.
討 論
間充質干細胞具有多向分化潛能,能支持造血和促進造血干細胞植入,具有調節免疫等特點。臨床上主要用于治療機體無法自然修復的組織細胞和器官損傷等多種難治性疾病,并且作為免疫調節細胞,治療免疫排斥和自身免疫性疾病[4 -5].與骨髓、外周血、脂肪及胚胎等來源的間充質干細胞相比,胎盤間充質干細胞具有來源廣泛、取材方便、病原微生物感染率和免疫排斥發生率較低、無致瘤性以及不涉及倫理限制問題等特點。與捐獻骨髓或采集動員外周血相比,供者無痛苦,感染機會少,擴增能力強,具有更大的應用潛能[6 -7].本實驗結果表明,胎盤間充質干細胞制劑體外無溶血和致紅細胞聚集作用,提示胎盤間充質干細胞制劑在臨床應用時產生溶血和致紅細胞聚集的可能性很小。
參考文獻:
[1] 丁志,楊松林 . 間充質干細胞生物學特性及其分化潛能[J]. 中國組織工程研究與臨床康復,2011,15: 147 -150.
[2] 李麗春,何治,李劍平 . 胎盤間充質干細胞的體外誘導分化[J].中國組織工程研究,2013,6: 1116 -1121.
[3] 國家食品藥品監督管理總局指導原則課題研究組 . 藥物刺激性、過敏 性 和 溶 血 性 研 究 技 術 指 導 原 則[EB/OL].
[4] 朱金海,陳燕凌 . 骨髓間充質干細胞分離培養及在移植肝中定居能力的研究[J]. 福建醫科大學學報,2010,44: 45 -48.
[5] 李麗春,李劍平 . 基因轉染間充質干細胞的臨床治療: 特點與問題[J]. 中國組織工程研究,2014,18: 2257 -2262.
[6] 朱少芳,付霞霏,胡紅波 . 人胎盤間充質干細胞大鼠體內移植的初步免疫學研究[J]. 中國現代醫生,2013,51: 5 -10.
[7] 穆曉紅,徐林,趙子義,等 . 人胎盤與骨髓源性間充質干細胞體外培養及生物學特性對比[J]. 中國組織工程研究與臨床康復,2009,13: 3708 - 3712.