細胞衰老是指細胞生長永久阻滯于細胞周期的G1期，出現形態、生化及表觀遺傳的變化特性，是正常細胞必然的歸宿[1].衰老細胞的聚集會導致其所在組織或器官發生衰老相關性疾病，去除這些衰老細胞則會延緩疾病的發生，從而延緩整個生物體的衰老。此外，研究表明細胞衰老是繼細胞 DNA修復和細胞凋亡之后的第三大癌癥防御機制，與腫瘤的發生、發展以及治療密切相關。
MicroRNA 是長約 21 ~ 23nt 的非編碼 RNA,通過特異性抑制靶 mRNA 翻譯或者降解 mRNA 來調節靶基因的表達[2].miRNA-17-92 家族位于人 13號染色體上，編碼 miR-17-5p（ miR-17） 、miR-17-3p、miR-18a、miR-19a,miR-20a、miR-19b 及 miR-92a 7個成熟的 miRNAs.近年研究發現，miRNA-17-92家族在心、肺、免疫系統的發育中發揮重要作用[3-4],并與前列腺癌、肺癌、乳腺癌及胃癌等多種腫瘤的發生密切相關[5-7].作為 Oncomirs 領域第一個被發現的癌基因，miR-17-92 家族的研究受到廣泛的關注[8].Matthias 等[9]通過芯片分析發現，miR-17、miR-19b、miR-20a 和 miR-106a 在復制性衰老的細胞中表達下調，但具體機制尚未明確。本實驗通過分離培養原代人包皮成纖維細胞（ human foreskinfibroblasts,HFF） ,研究 miR-17 對原代細胞細胞周期的影響，初步探討 miR-17 調節細胞衰老的分子機制。
1 材料與方法
1. 1 材料
1. 1. 1 細胞培養 包皮標本來源于山東大學齊魯醫院泌尿外科 l 例 7 歲健康男孩包皮環切術切除的包皮，患者簽署知情同意書，同意包皮用于醫學科學研究。本研究已獲得山東大學醫學院倫理委員會批準。HFF 傳代培養于含 10% 小牛血清的 DMEM 高糖培養基，在 37 ℃、5%CO2細胞培養箱內培養。
1. 1. 2 主要試劑 DMEM 高糖培養基購自美國Hyclone 生物化學制品有限公司，小牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司，聚凝胺（ polybrene） 和嘌呤霉素（ puromycin） 均購自美國 Sigma 公司，重組慢病毒 Lenti-miR-17 和 Lenti-NC 均購自上海吉瑪制藥技術有限公司，逆轉錄及 PCR 反應試劑盒購自日本 TaKaRa 公司，兔抗人波形蛋白（ vimentin） 單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司，CCK-8試劑盒購自日本株式會社同仁化學研究所公司，衰老相關 β-gal 染色試劑盒購于美國 CST 公司，p21一抗購自武漢三鷹生物技術有限公司，cyclin D1 購自美國 Santacruz 公司，PVDF 膜購自美國 Millipore公司，ECL 試劑購自上海碧云天生物技術有限公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 HFF 的分離和體外培養 手術剪去皮下組織和真皮網狀層，剪成 1 mm3大小皮片； 用 PBS 反復漂洗 3 次； 加入胰酶，37 ℃溫箱消化 1 ~2 h; 加入DMEM 培養基，輕輕吹打，200 目不銹鋼濾網過濾，將細胞液 1 000 r/min 離心 10 min,棄上清，加入DMEM 培養基漂洗 2 次，每次離心 5 min,所得細胞用含 10%小牛血清的 DMEM 培養基混勻并轉移至培養瓶中靜置培養，每兩天換一次； 待原代培養中長出的成纖維細胞接近或達到匯合，按 1∶3 的比例傳代培養。
1. 2. 2 培養 HFF 細胞的鑒定 將原代 HFF 細胞接種在細胞爬片上，培養至細胞接近融合狀態，以兔抗人波形蛋白（ Vimentin） 單克隆抗體為一抗，用鏈酶親和素 - 生物素 - 過氧化物酶（ SABC） 法進行免疫細胞化學染色。顯微鏡下觀察并拍照。
1. 2. 3 穩定表達 miR-17 成纖維上皮細胞系的建立與篩選 待 HFF 細胞長至 70% 左右，棄去原培養液，用 PBS 沖洗一遍，加入含 miR-17 重組慢病毒的DMEM 培養基 （ MOI = 50 ） ,同時加入 8 μg / mLpolybrene促進病毒的感染，將細胞放置 37 ℃ 孵箱孵育 24 h,棄去含病毒的培養基，改換 DMEM 培養基。24 h 后，消 化 病 毒 感 染 的 HFF,將 細 胞 接 種 至100 mm培養皿，同時加入 puromycin 進行篩選。熒光倒置顯微鏡觀察 HFF-miR-17 及 HFF-NC GFP 表達。
1. 2. 4 qRT-PCR 檢測 HFF 中 miR-17 的表達 Trizol抽提細胞 RNA,逆轉錄合成 cDNA,miR-17 檢測引物（ 擴增長度： 246 bp,Tm = 56 ℃） : 上游： 5'-CT-GTCGCCCAATCAAACTG-3',下游： 5'-GTCACAA-TCCCCACCAAAC-3'; GAPDH: 上游 5'-GCACCGT-CAAGGCTGAGAC-3',下游 5'-TGGTGAAGACGC-CAGTGGA-3'.qRT-PCR 反應條件按日本 TaKaRa公司 SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR Kit 說明書操作。
1. 2. 5 細胞生長曲線測定 取 HFF-NC 和 HFF-miR-17 對數生長期細胞制成單細胞懸液，接種到 96孔板中，每孔 1. 5 ×103個細胞，每 24 h 取 3 個孔換液后加入含 10% CCK-8 的 DMEM 培養液，在培養箱內孵育 1 h,用酶標儀測定在 450 nm 處的 OD 值，連續計數 6 d.以 OD 值為縱坐標、時間為橫坐標繪制生長曲線。
1. 2. 6 β-半乳糖苷酶染色 將 HFF-miR-17 細胞及其對照細胞用常規方法在 6 孔板中培養，細胞密度達到 60% ~ 80% 時開始染色，倒掉細胞培養基，PBS 沖洗一次，加 3% 的甲醛固定 5 min; PBS 沖洗，加入 1 mL /孔新鮮配置的 SA-β-gal 染液，用封口膜封住 6 孔板防止液體蒸發，37 ℃無 CO2培養箱中過夜； 倒置顯微鏡下觀察是否有變藍色的衰老細胞，并拍照保存。
1. 2. 7 流式細胞術檢測細胞周期 待培養皿中細胞生長至對數生長期，向培養瓶內加入 10 pg /mL的博來霉素（ Bleomycin） ,培養 24 h.終止培養，胰酶消化收集細胞，用細胞計數板進行細胞計數，據細胞數量調節每管細胞數為（ 0. 5 ~1. 0） ×106個，PBS洗3 遍，棄上清，每管加入1 mL 70%預冷乙醇中，吹打均勻，4 ℃固定12 h 以上。PBS 洗滌去乙醇，1000r /min,5 min,離心半徑 13. 5 cm,洗 2 遍。將細胞重懸于含 RNase A （ 70 μg /mL） 的 PBS-propidiumio-dide（ PI,50 μg / mL ） ,避光反應 30 min.用流式細胞儀測定細胞周期，并用 FlowJo software 進行細胞周期分析。
1. 2. 8 Western blotting 檢測 p21 和 cyclin D1 蛋白表達 冰上加裂解液裂解細胞，離心取上清，BCA法測蛋白濃度，蛋白上樣 50 μg,經 10% SDS-PAGE垂直凝膠電泳后，移至 PVDF 膜上，5% 脫脂奶粉37 ℃ 搖床封閉 2 h,用特異性抗 p21,cyclin D1 和GAPDH 的一抗進行孵育，4 ℃ 過夜，經 TBST 沖洗10 min × 3 次后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，37 ℃ 搖床孵育 1 h,TBST 沖洗 10 min × 3 次，ECL顯影曝光。
1. 3 統計學處理 采用 GraphPad Prism 4. 0 軟件，并在實驗組間進行雙因素方差分析檢驗。P <0. 05為差異有統計學意義。實驗結果均重復 3 次。
2 結 果
2. 1 HFF 細胞的鑒定 見圖 1.由于波形蛋白為成纖維細胞內的特異性蛋白，實驗組用兔抗人波形蛋白單克隆抗體作為一抗，采用 SABC 法對細胞進行免疫化學染色，顯微鏡下觀察，細胞呈長梭形或多角形，細胞胞漿呈棕色，胞核為淡藍色，顯示為人皮膚成纖維細胞。
2. 2 感染效率鑒定及 miR-17 的表達 見圖 2.熒光倒置顯微鏡下，綠色熒光分布于 HFF-miR-17 和HFF-NC 細胞內。與光學顯微鏡下同一視野對比，90% 以上細胞顯示綠色熒光，提示感染成功。利用qRT-PCR 技術檢測到 miR-17 在 HFF 細胞中過表達。
2. 3 miR-17 促進 HFF 增殖 見圖 3.與對照細胞HFF-NC 相比，穩定表達 miR-17 的 HFF- miR-17 細胞增殖能力明顯增強。
2. 4 miR-17 抑制 HFF 衰老 見圖 4.HFF-miR-17細胞顯示出較弱的 β-半乳糖苷酶染色，不到 1% 的細胞染色為陽性； 而對照細胞 HFF-NC 中有高達20% 的細胞染色結果為陽性。
2. 5 miR-17 對 HFF 細胞周期影響 見圖 5.HFF-miR-17 細胞株與對照 HFF-NC 相比，停滯在 G1期的細胞明顯減少（ 81. 5% vs 72. 6%） ; 用 DNA 破壞物質 Bleomycin 處理細胞后，72. 9% 的 HFF-NC 細胞停滯在 G1期，僅有 2. 5% 的 HFF-NC 細胞能夠越過 G1期進入 S 期，而 HFF-miR-17 細胞停滯在 G1期的顯著減少（ 54.6%） ,進入 S 期的增多（ 10.2%） .
2. 6 miR-17 對 HFF 細胞周期相關蛋白表達的影響 見圖 6.Western blotting 蛋白檢測顯示，與空白對照 HFF 細胞和陰性對照細胞 HFF-NC 相比，p21蛋白表達水平在 HFF-miR-17 中下調，而 cyclin D1蛋白表達水平顯著升高。
3 討 論
在腫瘤發生過程中，腫瘤發生的主要事件是腫瘤細胞逃逸衰老和死亡程序而進入永生化，因此誘導腫瘤細胞重新獲得衰老特性是抑制腫瘤生長和增殖的重要途徑。并且，衰老的腫瘤細胞也可能恢復細胞周期導致癌癥的復發，因此腫瘤細胞衰老是目前研究相對熱門的一種抗腫瘤機制[10].
HFF 是人二倍體原代細胞，其壽命短，可以用來作為研究細胞衰老的模型。本實驗利用 HFF 細胞建立了細胞衰老的體外模型，進一步觀察 miR-17抑制細胞衰老的作用及其機制。首先我們成功分離培養了 HFF 細胞，并且利用慢病毒包裝系統進行感染，建立了穩定表達 miR-17 的 HFF 細胞系。由于HFF 細胞轉染效率低，慢病毒對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力，通過我們實驗表明構建的Lenti-miR-17 慢病毒可有效感染原代細胞，為進一步實驗奠定了基礎。
本研究結果顯示，miR-17 過表達可導致 HFF細胞增殖能力明顯增強，并且 β-半乳糖苷酶染色陽性率顯著降低，說明 miR-17 過表達抑制了原代人包皮成纖維細胞的衰老。近年有研究表明，miR-17-92家族成員在壓力誘導的原代人二倍體細胞過早性衰老中的表達顯著下調[11],且在人成纖維細胞 WI-38細胞中抑制 miR-17-5p 和 miR-20a 的表達會導致細胞周期停滯在 G1期，從而誘導細胞的衰老表型[12].
本研究用 DNA 破壞物質 bleomycin 處理 HFF-miR-17 及對照 HFF-NC 細胞，結果發現藥物處理后，更多的 HFF-NC 細胞停滯在 G1期，進入 S 期的細胞減少，說明 DNA 損傷激活了 G1檢測點，使細胞停滯在 G1期； 而 HFF-miR-17 細胞的 S 期細胞比例明顯增加，提示 miR-17 表達能夠促進細胞繞過細胞周期 G1期檢測點，使更多的細胞進入 S 期，以使細胞擺脫由于 DNA 損傷而導致的細胞周期停滯，從而逃避細胞的衰老。
Cyclin D1 蛋白能夠促進分裂期的細胞完成 G1期到 S 期的轉換進入增殖階段[13],本研究發現cyclin D1 表達在 HFF-miR-17 細胞中顯著升高。P21 蛋白是腫瘤抑蛋白 p53 的下游靶標，它作為細胞周期蛋白依賴激酶（ Cdks） 的抑制因子，能夠通過抑制 Cdks 的活性誘導細胞周期的停滯[14].本實驗結果顯示，與空白對照 HFF 細胞和陰性對照 HFF-NC 細胞相比，p21 蛋白的表達在 HFF-miR-17 中有明顯的降低，與文獻報道一致[9,12].上述研究說明，miR-17 抑制原代細胞衰老的機制與其上調 cyclin D1蛋白、下調 p21 蛋白促進原代細胞的增殖有關，提示作為細胞周期負性調節因子 p21 可能負向調節cyclin D1[15],但尚需進一步研究。當前研究顯示，miR-17 可能是通過作用于 p53-p21 途徑，從而使HFF 越過 G1細胞周期檢測點，抑制 HFF 的衰老。
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