細胞凋亡作為一種增殖細胞最終的轉歸方式之一參與了多種骨改建過程,如骨縫發育、骨創修復、牽張成骨以及正畸牙槽骨改建等,它在骨骼系統中的研究越來越受到重視。本實驗探討擴張力對大鼠腭中縫組織改建過程中細胞凋亡的影響及細胞凋亡在擴張力作用下大鼠腭中縫組織改建新骨形成過程中的作用。
材料與方法
一、材料
1.動物4周齡健康雄性Wistar大鼠55只\\(由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供\\),清潔級,體重\\(78±5\\)g。由南京中醫藥大學實驗動物中心飼養。
2.主要試劑脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法\\(TUNEL\\)細胞凋亡檢測試劑盒\\(美國Promega公司\\)。
二、方法
1.建模與分組55只大鼠隨機分為實驗組\\(A組,25只\\)和對照組\\(B組,30只\\)。
A組再分為五個亞組:A1組擴弓1d,A2組擴弓2d,A3組擴弓4d,A4組擴弓4d并固定3d,A5組擴弓4d并固定7d;B組再分為六個亞組:B0組為擴弓前對照,B1組、B2組、B3組、B4組、B5組分別與A組對應,均不擴弓。每組5只。參考Kobayashi等的實驗方法建立大鼠上頜擴弓模型。
3%戊巴比妥鈉\\(中國醫藥集團上?；瘜W試劑公司,SCRC69020180,40mg/kg\\)腹腔注射麻醉下,安裝兩眼簧腭中縫擴張器,固位臂插于第一、二磨牙鄰接點之下,初始力值為50g[即0.49N,由測力計\\(Dentaurum,Germany\\)測得]。擴弓2d后,加力一次,約50g。擴弓4d后,用正畸專用樹脂\\(Orthocryl160-112-00,Germany\\)口內粘固擴弓器的兩眼簧,固定期為7d。
2.組織標本的處理過量戊巴比妥鈉處死,切取上頜骨腭中縫組織塊。取材部位:上頜第一、二磨牙之間的腭板組織,用10%甲醛固定24h,常規進行脫鈣、脫水、透明、浸漬、石蠟包埋。沿牽張方向冠狀位切片,腭中縫組織石蠟切片制成5μm厚的連續切片,行常規HE染色,光鏡下觀察腭中縫組織的形態學改變,TUNEL標記法標記凋亡細胞。
三、統計學處理
用SPSS 11.5統計軟件進行分析。計量數據以均數±標準差\\(珚x±s\\)表示,組間兩兩比較采用成組t檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。
結果
一、組織學觀察
HE染色切片經光學顯微鏡觀察,可見正常的鼠腭中縫由兩側上頜骨腭突板經中央的聯合層相接而成?？p組織從內到外依次可見以下結構,即中央豐富的間充質樣骨軟骨前體細胞層和兩側成熟的肥大軟骨細胞層,最外側為具有骨髓腔的骨板組織。
二、TUNEL檢測細胞凋亡
激光共聚焦掃描顯微鏡下呈黃色熒光的細胞為凋亡細胞,紅色熒光為用碘化丙啶\\(PI\\)對所有細胞核進行復染的結果。
A1組兩側骨緣處及附近骨小梁之間的凋亡細胞數明顯增多,平均每高倍視野下\\(43±6\\)個凋亡細胞,A1組細胞凋亡現象多于B1組\\(P<0.05\\);A2組凋亡細胞數有所減少,平均每高倍視 野 下 \\(28±5\\)個凋亡細胞,仍多于B2組\\(P<0.05\\)。A3組凋亡細胞數有上升趨勢,平均每高倍視野下\\(35±5\\)個凋亡細胞,多于A2組凋亡細胞的數目\\(P<0.01\\);A4組凋亡細胞明顯減少,與B4組比較無統計學差異,平均每高倍視野下\\(15±2\\)個凋亡細胞,伴隨著新骨的形成,A5組在骨縫組織邊緣及附近骨小梁內可見散在凋亡細胞,與B5組無統計學差異\\(見封二圖1\\)。而在B組僅見少量凋亡細胞散在分布于骨小梁之間,B組各組之間細胞凋亡數和分布無統計學差異,平均每高倍視野下\\(12±3\\)個凋亡細胞。
討論
細胞凋亡過程中,染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量的黏性3′-OH末端,在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶\\(rTdT\\)的作用下,可將結合有熒光素或堿性磷酸酶的脫氧核糖核苷酸標記到DNA的3′-OH末端,對凋亡細胞進行檢測,這類方法稱為TUNEL。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂,因而沒有3′-OH形成,很少能夠被染色。
TUNEL實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法,對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色,能準確地反應凋亡細胞典型的生物化學和形態特征,是一種快速、方便且靈敏度和特異性較高的檢測方法。
本實驗采用的熒光標記TUNEL試劑盒對脫鈣后的骨組織石蠟切片具有較高的特異性和靈敏度。研究結果顯示,生長發育期的大鼠腭中縫兩側的骨組織中存在少量的凋亡細胞,呈散在分布。說明細胞凋亡作為一種機體內的固有機制,參與了大鼠腭中縫組織的生長發育過程。兩次加力后凋亡細胞數的上升提示擴張力可以誘導凋亡細胞數量的改變,應力介導的細胞凋亡參與了擴張力作用下的腭中縫組織改建過程。
骨細胞是分布在鈣化骨基質中的靜止成骨細胞,在骨組織更新中的作用尚存爭議。Gu等認為局部的骨細胞凋亡在誘發局部的骨改建過程中起著主要作用。Clark等研究結果顯示,骨細胞的凋亡可能在骨愈合信號傳導過程中,在誘導破骨細胞的分化和增殖過程中起著重要的作用。
Li等研究發現牽張成骨過程中,凋亡細胞主要出現在纖維組織和礦化前組織之間的過渡區,以及生長中心附近的新骨表面或周圍,細胞凋亡與牽張成骨的新骨形成和骨組織改建過程密切相關。腭中縫組織的擴張屬于典型的縫牽張成骨過程。本研究發現擴張力作用于腭中縫組織之后,細胞凋亡的變化主要出現在骨縫邊緣及附近的骨小梁內,兩次加力后凋亡細胞數均有上升,提示牽張力可以誘導骨細胞的凋亡,而在固定期,伴隨著新骨的形成和腭中縫組織的恢復,骨縫邊緣及附近骨小梁內骨細胞的凋亡數目恢復正常,與對照組比較差異無統計學意義,提示應力介導的骨細胞的凋亡在骨改建的誘發過程中可能起著某種信號傳導的作用,對縫組織牽張后的骨改建有著重要的生物學意義。分析其機制可能:骨縫邊緣及附近骨小梁內的骨細胞受到牽張力的作用后發生了凋亡,凋亡的骨細胞可以促進附近的軟骨細胞繼續分泌軟骨基質,同時加速中央間充質樣細胞的分化、增殖和成熟,繼而形成類骨質,而在固定期,凋亡的骨細胞已通過一定的途徑被機體清除,故而實驗組與對照組差異無統計學意義。
雖然本實驗所使用的熒光TUNEL標記法對于石蠟切片中凋亡細胞的檢測具有較高的特異性和靈敏度,但是由于其無法精確的顯示凋亡細胞的形態,故要想明確凋亡細胞的種類,還需要進一步的驗證。而且腭中縫受到機械刺激所產生的適應性改建機制比較復雜,細胞凋亡的傳導途徑和影響因素也比較多,要想了解其具體的調控機制和信號傳導通路,還有待于進一步的研究。
