目前,臨床上進行全髖關節置換術 \\(Total hiparthroplasty,THA\\) 所用金屬假體主要為鈷鉻鉬合金假體。當假體植入人體后,在機械磨擦與電化學腐蝕的作用下,長期使用會產生嚴重磨損,磨損產生大量的金屬顆粒,釋放大量金屬離子,使得金屬顆粒、離子在體內不斷積聚。隨后,積聚的金屬離子可以引起假體周圍的骨質溶解及假體的無菌性松動,這是大多數THA 失敗的主要原因。有文獻報道,假體置換術后病人血液和尿液中以及關節囊中金屬離子濃度遠遠超過生理所需,從而對機體整體或局部產生一系列影響。Morais 等發現在體外培養中,鉻和鎳都可存留于骨髓細胞中。磨損顆?？梢源碳と庋拷M織內的巨噬細胞、成纖維細胞、巨細胞以及破骨細胞。同時,磨損顆?？梢源碳ぱ仔约毎蜃雍碗念愐蜃拥暮铣珊歪尫旁黾?例如 TNF-α、\\(IL\\) -1β,IL-6,IL-8,IL-10,IL-12p40,IL-11、巨噬細胞趨化蛋白-1 等,這些都參與骨質溶解和骨量的丟失。
Tnfrsf17,為 B 細胞表面分子,屬于腫瘤壞死因子受體\\(tumor necrosis factor receptor,TNFR\\) 家族,為Ⅰ型跨膜受體。Tnfrsf17 主要表達于成熟的 B 淋巴細胞,對于 B 細胞的成熟和自身免疫反應發揮重要作用。Tnfrsf17 特異性的結合腫瘤壞死因子家族成員13b\\(TNFSF13B / TALL-1 / BAFF\\) ,并激活 NF-kappaB 和MAPK8 / JNK 通路。除此之外,Tnfrsf17 還可以與各種TRAF 家族成員結合,借此可以為細胞生存和分化傳導信號。但是,據此前文獻報導,Tnfrsf17 和 BAFF-R只表達于 B 細胞表面。
因此,鑒于金屬離子對機體的不良影響以及 Tnfrsf17具備的細胞生存和分化傳導信號作用,本實驗擬研究Cr3 +對成骨的毒性作用及對 Tnfrsf17 基因表達的影響。
1、 材料與方法
1. 1 溶液配制 溶液配制所需玻璃器皿使用前均經去離子水浸泡沖洗,烘干后盛制 Cr3 +溶液。所需 CrCl3·6H2O 粉末購于美國 Sigma 公司,準確稱量并溶于去離子水內制成母液備用。依次稀釋至目的濃度后使用火焰分光光度儀校正濃度。
1. 2 成骨細胞培養 SaO2成骨細胞購買于武漢博士德生物公司,培養于含體積分數 10% 的胎牛血清的Mccoy’5A 培養液,另外含 100 U / ml 的青霉素-鏈霉素。置于培養條件為 37 ℃、5%的 CO2孵箱中。每3 d換液 1 次,當瓶壁細胞豐度達 80%左右后用 0. 25% 的胰蛋白酶消化傳代。
1. 3 Cr3 +對成骨細胞的干預濃度 胰蛋白酶消化傳代 12 h 后,待細胞完全貼壁后換液,加入含 Cr3 +的細胞培養液,其濃度分別為 0. 1、1. 3 和 150 mg/L。
1. 4 細胞活性測定 96 孔板接種細胞,每孔 5 000 個細胞,每組設置 5 個復孔。Cr3 +溶液干預 24 h 后每孔加入 MTT \\(1 mg/ml\\) 50 μl,37 ℃孵育4 h,吸去孔內液體,加入 DMSO 液體150 μl/孔,振蕩10 min,用酶標儀選擇 490 nm 波長測定各孔吸光度\\(A\\) 值,其值與細胞數量成正比。
1. 5 細胞鈣結節測定 細胞貼壁后使用含 Cr3 +的培養液培養細胞 7 d,每 3 d 換液 1 次。按照 Von Kossa試劑盒說明書進行鈣結節染色,并于低倍光學顯微鏡下觀察,每個象限隨機取一個低倍視野,計算每孔 4 個視野計數之和。
1. 6 堿性磷酸酶活性測定 各濃度培養液干預成骨細胞后于相應時間節點終止培養。各瓶加 PBS 洗滌 3次,加入600 μl 0. 1% Tfiton X-100,于冰上用細胞掛刮除細胞,以使細胞膜破裂,離心,收集細胞裂解液,- 80 ℃ 凍存。用 BCA 試劑盒測定總蛋白濃度,堿性磷酸酶試劑盒測定 ALP 含量,最后計算相對的 ALP 活性。
1. 7 RT-PCR 法及普通電泳檢測 Tnfrsf17 基因 mRNA的表達 Trizol 法提取細胞中 RNA,使用 TOYOBO 反轉試劑盒反轉合成 cDNA,以此為模版采用 PCR 擴增試劑盒進行目的基因的擴增。用 TOYOBO SYBRqPCR 試劑盒進行 Real Time PCR 擴增。 用 PrimerPremier 5. 0 軟件設計引物,引物由上海生工生物工程服務有限公司合成。反應總體積為 20. 0 μl,包括5 μlDNA 模 版,10 μl 的 Master Mix 緩 沖 液,0. 2 μl20 mmol / L的上下游引物,4. 6 μl ddH2O。采用 ABI7300 Real Time PCR 儀,按照機器說明書進行 40 循環\\(95 ℃ 15 s,60 ℃ 45 s\\) 。用 Light Cycler Software version3. 5 進行數據分析,基因的相對表達參照 2ΔΔCt法計算,以 GAPDH 作為內參照。電泳條帶通過凝膠灰度值可以對 Tnfrsf17 基因 mRNA 的表達進行輔助分析。引物序列如下:
1. 8 Western 法檢測 Tnfrsf17 基因蛋白產物的表達3 種濃度金屬離子培養液干預成骨細胞后,于相應時間節點終止培養。各瓶加 PBS 洗滌 3 次,加入 600 μl蛋白裂解液\\(RIPA∶ PMSF = 100∶ 1\\) ,于冰上用細胞掛刮除細胞,以使細胞膜破裂,離心,收集收集上清,BCA法蛋白定量后調整蛋白濃度一致。取等量與 SDS 混勻后煮沸 5 min,然后經電泳、轉膜、封閉、抗體孵育和發光等步驟后采用熒光化學發光凝膠成像分析系統檢測蛋白表達,通過軟件分析各組蛋白條帶的灰度值并進行比較。
1. 9 統計學方法 采用 SPSS 18 統計軟件進行分析,計量資料用 x珋 ± s 表示,組間比較用隨機設計的兩樣本均數比較,隨機區組比較采用方差分析及 LSD-q 法,以P < 0. 05 為差異有統計學意義。
2、 結果
2. 1 成骨細胞活性及鈣結節結果 結果見圖 1。Cr3 +與成骨細胞共培養 24 h 后,細胞 MTT 實驗的 A 值明顯下降。根據 A 值計算細胞成活率,與對照組相比,0. 1、1. 3 和 150 mg / L 組細胞成活率分別下降了 2. 45% 、7. 32% 和 22. 70% ,差異有統計學意義\\(P < 0. 05\\) 。與對照組相比,150 mg/L 組,Cr3 +對成骨細胞鈣結節形成的影響較明顯,差異有統計學意義\\(P <0. 05\\) 。
2. 2 Cr3 +溶液對成骨細胞 ALP 的影響 結果見圖 2。
同一時間點相比,Cr3 +離子共培養成骨細胞的磷酸酶活性與對照組相比是有差別的\\(與對照組相比,P <0. 05\\) ; 對照組成骨細胞隨著時間延長,其堿性磷酸酶活性也降低。對于同一濃度的金屬離子共培養的成骨細胞細胞,隨著時間的延長,其堿性磷酸酶的活性也逐漸降低。這可能是因為在體外成骨誘導條件下,成骨細胞完成增殖后,細胞 ALP 活性會逐漸增高,而當細胞進入礦化期時則表現出較低的 ALP 活性。有文獻報導,ALP mRNA 在早期表達可增加 10 倍以上。
2. 3 RT-PCR 結果 從圖 3 可以看出,Cr3 +干預成骨細胞成長后,0. 1、1. 3 和 150 mg/L 組各組與對照組相比,Tnfrsf17 的表達水平均有所下降,但是 3 種濃度之間比較,抑制作用沒有差別,不具有統計學意義\\(P >0. 05\\) 。不同時間節點 PCR 結果顯示金屬離子對于Tnfrsf17 的表達自始至終發揮抑制作用,而且 24 h 組與 48 h 組、72h 組對基因表達的抑制作用有差別\\(P <0. 05\\) 。
2. 4 Tnfrsf17 蛋白表達結果 Cr3 +離子作用于成骨細胞后,由圖 4 可知 Tnfrsf17 蛋白的表達水平有所降低。
24 h 后作用不明顯; 48 h 時離子干預組 Tnfrsf17 蛋白表達開始下降,高濃度組結果較為明顯; 72 h 時與48 h相比,Tnfrsf17 蛋白表達繼續下降。同樣,高濃度組蛋白表達抑制作用更加顯著。將完成曝光的膠片放入掃描儀器中,選擇 3 次曝光的重疊值得圖 4。利用灰度值分析軟件對該圖進行數字分析,量化結果,并據此得圖 5。
3、 討論
THA 對于髖關節疾病具有緩解疼痛、改善關節功能、恢復肢體活動等優點,已成為治療髖關節疾病的經典手術之一,在臨床上得到了廣泛的應用。而且,金屬對金屬大直徑全髖置換和金屬對金屬髖關節表面置換以低脫位率、關節活動度大、穩定性高、磨損率低,尤其適合對活動量要求較高的年輕病人而受到廣泛關注。
臨床上最常用的假體金屬為鈷鉻鉬合金,其含鈷量為50% ,含鉻量 25%,這表明人工關節置換術后病人體內金屬離子的蓄積主要以鈷鉻離子為主。Sauvé等對初次假體固定失敗病人進行返修術,以金屬對高分子聚乙烯假體代替初次使用的 MOM 假體,結果患者血清 Co2 +、Cr3 +濃度最后降至正常水平,表明金屬離子幾乎全部由 MOM 假體產生。雖然鈷、鉻等金屬離子作為微量元素為人體生長發育所必須,但 THA后病人體內金屬離子濃度遠遠超過生理所需。
假體松動是 THA 術后中晚期最主要的并發癥之一。關節假體周圍金屬離子濃度的測定值目前尚未統一,但其濃度遠高于外周血液金屬離子濃度。金屬關節界面假體植入人體后,可以在假體與骨面間形成一層界膜組織,界膜中含有大量活性細胞,高濃度的金屬離子會對假體周圍的這些活性細胞產生多種不良的生理影響,繼而引起假體松動。成骨細胞在骨形成過程中起重要作用,一旦成骨細胞的成骨功能受到影響,這勢必影響人工關節與骨面的整合,從而引起假體松動。
研究人員利用 SaO2成骨細胞,人為進行 Cr3 +離子干預,以此模擬假體周圍成骨細胞的生存環境。在傳代 12 h 后向培養液中添加 Cr3 +金屬離子,作用于成骨細胞 24 h 后通過 MTT 法檢測其活性,與此同時我們還通過顯微鏡觀察細胞形態,發現正常培養 SaO2細胞形態為梯形,細胞體積較大,而 Cr3 +離子干預后的SaO2細胞差異有較大差別。濃度越高,對細胞影響越明顯,細胞貼壁數目少且細胞體積小,伸展受限。通過MTT 法檢測細胞活性發現 A 值基本與細胞數目成正比,細胞數目越多其 A 值越大,從而得到其細胞活性值越高。據此可知 Cr3 +離子對成骨細胞的形態及活性有較顯著的影響。成骨細胞的主要功能是形成骨組織,因此,體外培養的成骨細胞形成骨組織中有機成分及礦化物質的能力是成骨細胞成骨能力的反應。實驗結果顯示與對照組相比,150 mg/L 組 Cr3 +離子對成骨細胞鈣結節形成的影響較明顯,差異有統計學意義。
而 0. 1 和 1. 3 mg/L 組可能由于誤差的原因,結果顯示Cr3 +離子對成骨細胞鈣結節形成的影響較小,差異沒有統計學意義。但是據國外文獻報導,0. 1 mg/L等低濃度 Cr 離子對成骨細胞的骨化能力也具有較為明顯的影響。另外,堿性磷酸酶活性作為成骨細胞成熟的重要標志,其在細胞中表達的多少,能合理地反映成骨細胞的分化程度和功能狀態。由研究的實驗結果可知,短期\\(12 h\\) 內,堿性磷酸酶的表達量較高,并且有明顯的劑量效應; 隨著時間的延長,長期\\(72 h\\) 則堿性磷酸酶的表達受到金屬離子的影響,表達量下降,也呈現出劑量效應。
有研究指出鈷鉻等金屬離子能通過氧化途徑誘導滑膜細胞和骨髓巨噬細胞釋放 IL-1β、IL-6 和 TNF-а,而這些細胞因此也間接參與了假體松動的過程。
其中 TNF-а 通過與其受體結合而發揮對成骨細胞的間接調控作用,然而 Tnfrsf17 為 TNF-а 通路受體之一,本研究發現 Cr3 +對 Tnfrsf17 的影響可能為 Cr3 +對成骨細胞發揮了直接調控作用。根據 PCR 結果可知,成骨細胞在 Cr3 +離子存在環境下,其 Tnfrsf17 基因的表達異常于正常情況,即表達下調。利用蛋白質印跡技術也可以表明成骨細胞在 Cr3 +離子的干預下,Tnfrsf17 基因的下游蛋白產物的表達量也受到影響。與正常對照組相比,表達量降低。
綜上所述,本課題通過 Cr3 +離子對成骨細胞的毒性研究,以及對 Tnfrsf17 基因和蛋白表達的驗證表明:Cr3 +離子對成骨細胞具有毒性作用,影響其增值及成骨活性,同時證明了 Tnfrsf17 表達于成骨細胞并且在Cr3 +的干預下其表達受到抑制。另外,本研究的不足之處是沒有闡明 Cr3 +抑制 Tnfrsf17 基因表達后對成骨細胞生物學功能的影響,有待于進一步研究。
參考文獻:
[1] 袁曉軍,戴閩. 全髖關節置換術后金屬離子對成骨細胞的生物學影響[J]. 國際骨科學雜志,2009,30\\(3\\) : 173-174.
