多環芳烴\\(Polycyclic aromatic hydrocarbons,簡稱 PAHs\\) 是存在于環境中且含有兩個以上苯環的碳氫化合物,包括菲、芘、苯并芘\\(BaP\\) 等 150 余種. 近年來,人類活動的加劇,特別是煤、石油等化石燃料和木材的不完全燃燒,破壞了其在環境中原有的平衡,使環境中 PAHs 大量增加. 作為一種典型的持久性有機污染物,PAHs 類化合物已在世界各地被檢出,此外 PAHs 類化合物還具有強烈的致癌作用、致畸作用和致突變作用,可以通過呼吸道、消化道和皮膚進入人體,是最早發現也是數量最多的致癌物之一.由于 PAHs 獨特的性質,其也具有生物蓄積性和半揮發性,因此是大氣污染監測的重要目標之一.
肺泡巨噬細胞\\(Alveolar macrophage,簡稱 AM\\) 是存在于肺泡隔中較大的圓形或卵圓形巨噬細胞,可吞噬、清除外來的塵?；虿≡?參與肺的防御和免疫,還可產生大量的生物活性物質,維持肺和機體的正常生理活動.菲是一種典型的三環芳香烴,易揮發,很多條件下以氣態存在,可經呼吸系統進入人體,對動物有致癌作用.目前關于菲對植物生長發育的影響有一些報道,研究結果表明氧化損傷為菲毒性的可能機制,而關于菲對動物毒性作用的報道并不多.本文以菲為研究對象,測定了染毒后細胞中谷胱甘肽 \\(Glutathione,GSH\\) 、超氧化物歧化酶\\(Superoxide dismutase,SOD\\) 和丙二醛\\(Malondialdehyde,MDA\\) 含量,觀察了線粒體融合/分裂狀態,以此探討低環多環芳烴對大鼠 AM 的毒性機制.
1、 材料和方法
1.1 儀器和主要試劑
CO2培養箱\\(Thermo Forma 公司\\) 、低溫高速離心機\\(Thermo Forma 公司\\) 、TU-1810 紫外可見分光光度計\\(北京普析通用儀器公司\\) 、HZQ-F100 振蕩培養箱、酶標儀、激光共聚焦顯微鏡.RPMI1640 培養液、小牛血清、MDA 試劑盒、SOD 試劑盒、GSH 試劑盒、二甲基亞砜\\(DMSO\\) 、0.4%的臺盼藍、四甲基偶氮唑鹽\\(MTT\\) 、考馬斯亮藍 G-250、0.18%胰蛋白酶、菲母液\\(5 mg·mL-1甲醇\\) 、線粒體熒光試劑\\(Mito-Tracker Green\\) .
1.2 實驗方法
1.2.1 大鼠 AM 的提取和培養
每次實驗選體重 220—250 g 的雄性、清潔 Wistar 大鼠 4 只,腹腔注射 1%戊巴比妥那 1.0 mL,腹主動脈放血致死,打開胸腔,用滅菌的磷酸鹽緩沖液\\(PBS,pH = 7.0\\) 灌洗雙肺,灌洗液\\(BLAF\\) 于3000 r·min-1、4 ℃離心 10 min,棄上清液,沉淀用含 10%小牛血清的 RPMI1640 培養液洗滌,臺盼藍拒染法計數,稀釋\\(2×106—3×106個·mL-1\\) ,將細胞稀釋液按每皿 3 mL 分裝于細胞培養皿中,置于 37 ℃、5% CO2培養箱中培養 2 h,小心棄原培養液,用 PBS 輕輕洗滌 1—2 次,去除非貼壁的細胞.
用不同濃度的菲\\(20、40、60、80、100 μg·mL-1\\) 染毒,同時設對照組\\(只加培養液\\) .染毒 4 h,去培養液,以 PBS 清洗后用 0.18%的胰蛋白酶消化細胞,30 s 后棄消化液,用含小牛血清的 RPMI1640 培養液終止消化,輕輕吹打貼壁的細胞,將懸液轉移到 10 mL 離心管中,于 3000 r·min-1、4 ℃離心 10 min,用PBS 清洗兩次,之后加少許 PBS 凍存,備用.
1.2.2 細胞毒性的測定
采用 MTT 分析法.活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性 MTT 還原為溶解于二甲基亞砜\\(DMSO\\) 的藍紫色結晶———甲瓚\\(Formazan\\) ,用酶標儀在 490 nm 波長處測其吸收值,可間接反映活細胞數量.
將稀釋好的細胞懸液\\(1—2×105個·mL-1\\) 按每孔 100 μL 加到 96 孔培養板中,貼壁 2 h 后,用不同濃度的含菲培養液 100 μL 染毒,同時設一對照組\\(只加培養液\\) 、空白組\\(只加甲醇\\) 和一標準組\\(只加MTT 和 DMSO\\) ,每個濃度設 5 個平行,染毒 4 h 后,去原培養液,每孔加 100 μL RPMI 1640 培養液和20 μL MTT\\(5 mg·mL-1\\) 繼續培養,4 h 后去上清液,每孔加 150 μL DMSO,振蕩 10 min,將液體平行轉移到另一 96 孔板中,在酶標儀上測 OD 值,計算細胞的相對存活率.
1.2.3 AM 線粒體融合 / 分裂的觀察
觀察線粒體融合/分裂所用的熒光試劑為 Mito-Tracker Green.不同濃度菲染毒 4 h 后,用 0.18%的胰酶消化細胞,30 s 后,用含小牛血清的 1640 培養液終止消化,終止液轉移到 10 mL 離心管中,3000 r·min-1、4 ℃ 離心 10 min,去上清液,沉淀加入 37 ℃ 預溫育的染色工作液 1 mL,濃度為25 nmol·L-1,孵育 30 min 后,3000 r·min-1、4 ℃離心 10 min,棄上清,重新加入培養液 500 μL,用移液器吹打均勻,取一滴做標片,在激光共聚焦顯微鏡下觀察 AM 線粒體融合/分裂的狀態.
1.2.4 生理指標的測定
蛋白含量測定: 以牛血清白蛋白為標準溶液\\(1 mg·mL-1\\) ,作蛋白含量 0、10、20、30、40、50、60 μg 的標準曲線,采用考馬斯亮藍法,于 595 nm 波長下測其吸光值,通過標準曲線測得樣品中的蛋白含量.SOD、GSH 及 MDA 含量用試劑盒測定\\(購自南京建成公司\\) ,具體方法參見試劑盒說明書.
1.2.5 統計分析
實驗數據以平均值±標準誤差\\(Mean±SD\\) 表示,用 Excel 軟件對組間差異進行統計分析,P<0.05 表示差異顯著,用 Origin 8.0 完成制圖與分析.
2、 結果與討論
2.1 菲的細胞毒性
AM 是重要的吞噬細胞,可以清除肺中的壞疽碎片及塵埃等,當病原體被 AM 吞噬后,會與溶酶體融合并被消化掉,而 AM 也將死于消化過程中產生的混合物.如圖 1 所示,隨染毒濃度的增加,AM 成活率呈下降趨勢,低濃度\\(20 μg·mL-1\\) 組相對于較高濃度組\\(80 μg·mL-1、100 μg·mL-1\\) 而言,產生的混合物較少,AM 成活率下降較緩,當濃度大于 40 μg·mL-1時,染毒組與對照組相比差異達顯著或極顯著水平\\(P<0.05 或 P<0.01\\) .圖 1 空白為只加甲醇時的細胞成活率\\(以最大染毒濃度組的甲醇體積計算\\) ,與對照組相比,無顯著性差異.
2.2 不同濃度菲對 AM SOD 活力的影響
SOD 是保護細胞免受自由基侵襲的第一道屏障,能夠催化 O-·2與 H2O2反應生成 O2.SOD 作為重要的抗氧化酶,廣泛存在于生物體內,SOD 能及時修復受損細胞,復原自由基對細胞造成的傷害,但當有毒有害物質的濃度過高,產生的 O2-過多,超出 SOD 的清理能力時,SOD 活力就會減弱.如圖 2 所示,隨著染毒劑量的增加,SOD 活力呈下降趨勢,說明細胞的抗氧化能力減弱.在濃度大于 80 μg·mL-1時,與對照組相比,差異極顯著\\(P<0.01\\) .
2.3 不同濃度菲對 AM GSH 含量的影響
GSH 也是一種重要的抗氧化酶,可以清除體內的 O2-、H2O2、LOOH. 此外,GSH 還可與一些毒性分子及其代謝物結合,降低其毒性.當有毒有害物質增加時,O2-增加,GSH 的清理能力減弱,含量下降.如圖 3 所示,當染毒濃度大于 40 μg·mL-1時,隨著染毒濃度的升高,GSH 含量逐漸降低,且與對照相比,差異顯著\\(P<0.05 或 P<0.01\\) ,但在染毒濃度為 20 μg·mL-1時,GSH 含量略有上升,但與對照相比無顯著差異.其可能原因為低濃度處理時,細胞內的自由基增加,細胞中 GSH 含量上升以及時清理過量的自由基,是細胞的一種應激反應,隨著染毒濃度的升高,自由基的產生遠遠超出了 GSH 的清除能力,導致GSH 含量的降低.
2.4 不同濃度菲對 AM MDA 含量的影響
MDA 是脂質過氧化的產物,通常 MDA 的含量反映了脂質過氧化水平.當生物體內自由基過量時,MDA 含量就會增加,細胞受損害程度增強.如圖 4 所示,不同濃度染毒使得 AM 中 MDA 含量增加,且與其他指標相比在較低濃度 20 μg·mL-1時與對照相比差異就達顯著水平\\(P<0.05\\) ,高濃度處理時,與對照相比差異極顯著\\(P<0.01\\) .
2.5 菲對大鼠 AM 線粒體融合 / 分裂的影響
正常的細胞中,線粒體的融合與分裂是協同進行的,兩者保持動態平衡,這種平衡對維持線粒體的正常形態、分布和功能十分重要.線粒體融合/分裂平衡的紊亂將導致線粒體功能障礙,表現為 ATP 生成減少、氧自由基\\(ROS\\) 產生增多等,同時還將造成細胞功能損害和疾病的發生. 除此之外,線粒體融合和分裂的異常還能導致巨型線粒體\\(megamitochondria\\) 的出現.由圖 5 可以看出,不同濃度的菲處理,對 AM 線粒體的融合/分裂造成了一定的影響.
多、體積增大.菲進入細胞后,溶酶體需要不斷地將其消化掉,這就需要大量的能量,不斷的融合能使線粒體體積變大,基質增加,釋放大量的能量,同時菲的進入可能引起線粒體分裂相關基因\\(如 Drp\\) 損傷,導致線粒體分裂減少,在胞體內積聚,這就導致了巨型線粒體的出現,且隨著菲濃度的增加,巨型線粒體的數目越來越多,體積越來越大.
3、 結論
本研究采用體外細胞培養及染毒方法,選擇典型的低環多環芳烴菲為代表,以肺泡巨噬細胞為研究對象,研究了菲對肺泡巨噬細胞的生物學毒性,旨在闡明多環芳烴對呼吸系統的毒理機制,研究發現:
\\(1\\) 不同濃度的菲造成細胞成活率的下降,特別是在高濃度處理下,細胞成活率急劇降低,說明了菲對 AM 具有細胞毒性.
\\(2\\) 菲處理后,AM 中 SOD、GSH 含量都有所下降,而 MDA 含量在低濃度下就有所上升,且均呈現一定的劑量-效應關系,揭示過量自由基的生成并對細胞造成氧化損傷是菲對 AM 毒性的一條可能途徑.
\\(3\\) 正常細胞的線粒體處于不斷的分裂/融合當中,始終保持平衡,而菲處理后,細胞線粒體融合/分裂異常,出現了大量的巨型線粒體,導致細胞正常功能的損害,這也是菲細胞毒性的可能機制.
參考文獻:
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