超聲波是一種高頻聲波，也是機械能的一種形式，通過高頻 \\( 1 ～12 MHz\\) 的壓力波來傳遞能量，低強度脈沖超聲波 \\( LIPUS\\) 一般指強度 ＜ 100 mW/cm2的超聲波。20 世紀 80 年代初 Duarte 首先報道了 LIPUS \\( 強度為 30 mW/cm2\\) 能加速動物骨折愈合，他們的研究進一步發現: 低強度脈沖超聲波可刺激骨折愈合，縮短愈合時間。根據 Wolf 定律 “骨的形成與結構可隨外力的大小與方向而重建，骨骼的生理反應和愈合過程可受機械力學影響”，超聲產生的機械力刺激是否也能對骨骼的愈合產生影響逐漸受到人們的關注。干細胞的分化方向不僅取決于其自身與外界調控信號之間的相互作用，而且還受到周圍組織的三維結構及機械力的影響。而脂肪干細胞\\( adipose derived stem cells，ADSCs\\) 以其來源豐富、較易獲取、一次取材即可獲取大量細胞及對機體創傷較小等優點，成為繼 BMSC 以外另一個研究熱點。本實驗旨在研究低強度脈沖超聲波對脂肪干細胞成骨分化效能的影響。
1 材料、儀器和試劑
1. 1 標本采集脂肪細胞取自于無錫市人民醫院 18 ～ 45 歲手術患者，部位為腹部及腰背部處，不合并重大內科疾病，經知情同意。取下的脂肪細胞經分離培養后用于本實驗。
1. 2 實驗試劑和材料DMEM － 低糖培養基 \\( 美國 Hyclone 公司\\) ，Gibco胎牛血清 \\( 美國 Invitrogen 公司\\) I 型膠原酶、胰蛋白酶、BSA \\( 美國 Sigma 公司\\) ，青鏈霉素 \\( 美國 GIBeo公司\\) ，地塞米松 \\( 美國 Sigma 公司\\) ，維生素 C \\( 美國 Sigma 公司\\) ，油紅 O \\( 美國 Sigma 公司\\) ，吲哚美辛 \\( 美國 Sigma 公司\\) ，IBMX \\( 美國 Sigma 公司\\) ，EDTA \\( 美國 Sigma 公司\\) ，CD29 /CD14 /CD44 /CD45 /CD105 抗人單克隆抗體，抗鼠 IG1、IG2，EDTA \\( 美國 Sigma 公司\\) 堿性磷酸酶檢測試劑盒 \\( 南京建成\\) ，培養板及培養瓶 \\( Corning 公司\\) ，Exogen2000 超聲波骨折治療儀 \\( 北京諾亞\\) ，醫用超聲耦合劑 \\( 上海洪康\\) 。
1. 3 脂肪間充質干細胞 \\( ADSCs\\) 的分離培養脂肪組織剪成 1 mm ×1 mm ×1 mm 左右小塊。轉移至 5 ml 的離心管中，加入 5 倍體積的 0. 1% Ⅰ型膠原酶溶液，密封離心管。將離心管放入 37℃的恒溫振蕩箱中，振蕩消化 45 ～60 min，等體積 DMEM － 低糖培養基中和，1 500 r/min 離心 10 min。棄上清，用PBS 溶液離心漂洗沉淀兩次。加入培養基重懸沉淀，200 目不銹鋼篩網過濾，1 500 r /min 離心 5 min。培養基重懸后，制成細胞懸液，然后細胞計數，按 2 ×105的密度接種于 35 cm ×35 cm 的培養瓶內，置于 37℃、5% CO2的飽和濕度恒溫培養箱中培養。于 12 h 后首次半量換液，之后每 3 d 更換 1 次培養液。當細胞達到 90%融合時用約 1 ml，0. 02% EDTA + 0. 25% 胰蛋白酶的混合消化液 \\( 1∶1 體積比\\) 37℃消化 1 ～2 min，待細胞回縮成圓形時加入培養基中和，并以 1∶2 或1∶3傳代培養。
1. 4 ADSCs 的表面抗體檢測取第 6 代生長接近融合的細胞，以 0. 02% EDTA+ 0. 25% 胰蛋白酶的混合消化液消化，加入適量 PBS，以 1 300 r/min 離心 5 min，棄上清，收集細胞。以Buffer 溶液重懸細胞，調整細胞密度為 3. 0 × 106/ml。
根據需要，準備好樣品管 \\( 2 ml Ep 管\\) 并于管上標記好抗體信息。于每個樣品管內各加入 100 μl 細胞懸液。按 照 試 劑 推 薦 劑 量 分 別 加 入 CD29、CD44、CD45、CD14、CD105，鼠 IG1 和 IG2 作為對照。
1. 5 ADSCs 向成骨誘導及鑒定取所得第 4 代脂肪干細胞，傳代消化后，接種于4 塊六孔板中，待細胞生長至 90% 融合時開始本實驗，分為四組，\\( 1\\) 陰性對照組: ADSCs 于完全培養基中培養，不接受 LIPUS 刺激; \\( 2\\) LIPUS 組: AD-SCs 于完全培養基中培養，接受 LIPUS 刺激; \\( 3\\) 成骨誘導組: ADSCs 于成骨誘導培養基中培養; \\( 4\\)LIPUS 聯合成骨誘導組: ADSCs 在成骨誘導培養基中培養，接受 LIPUS 刺激。設置 LIPUS 參數為: 頻率1. 5 MHz 的正弦超聲波，脈沖頻率 1. 0 kHz，脈沖時間200 ms，間隙時間為 800 ms，空間時間平均強度為100 mW /cm2。實際 LIPUS 刺激和虛設 LIPUS 刺激均是 1 次/d，在相同的時間點進行，每次 20 min。虛設的 LIPUS 刺激時超聲波發生器不打開。在進行細胞周期檢測和成骨分化實驗時，ADSCs 均使用 6 孔板培養，實驗所使用的超聲波探頭直徑為 5 cm，大于培養皿底部，可在培養皿底部的耦合劑上，探頭平面向上，培養皿水平放置。刺激在室溫下進行。刺激后放回培養箱。茜素紅染色: 培養 2 周后，向各六孔板中加入 40 mg/cm3多聚甲醛固定 15 min，PBS 洗 3 次，加入 0. 2%茜素紅溶液，37℃ 染色 30 min，蒸餾水洗去多余染料，晾干后，甘油明膠封固，鏡檢。堿性磷酸酶 \\( ALP\\) 活性測定: 各組細胞培養 7、14 d 后，棄去培養液，終止培養，采用 PBS 洗 3 次，隨后加入pH 7. 4 的十二烷基硫酸鈉溶解細胞，以 1 000 r /min離心 10 min，取上清液采用試劑盒行堿性磷酸酶活性測定。
2 結果
2. 1 ADSCs 形態觀察原代培養 12 h 后可見貼壁細胞，初始階段為小圓形，48 h 后可見短梭形、梭形及多角形 \\( 圖 1a\\) ，細胞突起相互連接，8 ～9 d 后單層細胞融合接近 90%。傳代細胞 6 h 即可觀察到貼壁、細胞生長迅速，多數為類成纖維細胞，圓形細胞逐漸減少，7 d 后細胞即可單融合。分選的第 3 代細胞開始形態均呈梭形，接近融合狀態，按 1∶2 或 1∶3 傳代培養，3 d 可長至融合狀態 \\( 圖 1b\\) ，細胞傳至第 10 代時，發現細胞形態特征無明顯變化?！緢D1.略】
2. 2 細胞表面標志物分析通過流式細胞儀分析第6 代 hADSCs 細胞表面特異性標記結果顯示: CD105: 99. 61%，CD29: 97. 54%，CD45: 0. 26% ，CD44: 97. 4% ，CD14: 2. 51% \\( 圖 1c ～g\\) 。
2. 3 茜素紅染色茜素紅染色結果顯示 LIPUS + 成骨誘導組茜素紅染色顏色最深，其次為單純誘導組，LIPUS 組幾乎染色無變化 \\( 圖 2a\\) ?！緢D2.略】
2. 4 ALP 活性測定結果成骨培養基誘導組堿性磷酸酶活性在第 7 d 和第14 d 比對照組分別增長了 93. 3% 和 238. 1% \\( P ＜0. 05\\) 。成骨培養基誘導聯合低強度脈沖超聲組的堿性磷酸酶活性在第 7 d 和第 14 d 比對照組分別增長了191. 8% 和 444. 2% \\( P ＜ 0. 05\\) 在第 7 d，成骨培養基誘導組和成骨培養基誘導聯合低強度脈沖超聲組的堿性磷酸酶活性無明顯差異，而在第 14 d，成骨培養基誘導聯合低強度脈沖超聲組的堿性磷酸酶活性明顯高于成骨培養基誘導組 \\( P ＜0. 05\\) 。
3 討論
超聲波的生物效應機制主要為溫熱效應、機械效應和理化效應。最早應用于治療的超聲波頻率為 1 ～3MHz，劑量一般為 1 ～ 210 W /cm2，且多為連續波。
LIPUS 的聲強一般不超過 30 mW /cm2，脈沖時間在200 μs 以內，重復頻率在 1 MHz 左右，作用時間不超過 20 min/d，其傳遞給組織的機械能量一般 ＜ 3 mg/cm2。LIPUS 使用時不會在接觸組織局部產生熱量，避免了熱損傷等不良反應，并能刺激細胞增殖及細胞外基質合成。研究發現，LIPUS 對骨折愈合具有明顯促進作用，特別是對于骨延遲愈合和不愈合具有較高的治愈率。Duarte 等通過大樣本的臨床前瞻性研究發現: LIPUS 對骨折 14 個月以上骨不連病例的治愈率達85% ，對延遲愈合病例治愈率達到了 91% 。但關于其促進骨折愈合的機制尚不甚明確，且目前研究大多集中在 LIPUS 作用于骨折局部的宏觀水平，對其在細胞水平的作用研究較少。骨折愈合是一個復雜而有序的病理過程，涉及一系列細胞的募集、增殖及分化。脂肪干細胞 \\( adipose derived stem cells，ADSCs\\) 為近年來新近發現的一種成體干細胞，作為一種來源于中胚層的成體干細胞具有多向分化的潛能，在向成骨細胞誘導的條件培養基中可向成骨細胞分化，是優秀的自體組織工程的種子細胞之一。
本實驗檢測到 LIPUS 刺激 ADSCs 后堿性磷酸酶\\( ALP\\) 活性的增強和礦化結節的形成。ALP 是成骨細胞分化的一個早期的標志，ALP 在骨化中起重要作用，在礦化開始之前其活性達到峰值，隨著礦化的進展，ALP 活性又會逐漸平穩甚至下調。本實驗發現，LIPUS 處理的 ADSCs 比對照組在 7 d 和 14 d 時表現出更高的 ALP 活性，這一結果接近先前的一個研究。
成骨細胞體外培養具有產生特異性鈣結節的能力，以提供骨組織形成的基礎條件，這是成骨細胞的另一重要特征。本實驗中也檢測到 LIPUS 刺激 ADSCs 后出現鈣染色結節。從上述的實驗結果中，作者推斷，LIPUS 作用可以增加鈣沉積從而導致 ADSCs 產生礦化結節。
總之，本實驗觀察到單因素強度為 100 mW/cm2的 LIPUS 促進 ADSCs 的成骨分化作用，聯合應用 LI-PUS 和成骨誘導培養基有望成為一種新的促進人脂肪干細胞成骨的方法，在組織工程中具有重大的應用潛能，其分子機制有待于在未來的研究中作進一步的探討。
參考文獻:
［1］ Miller DL，Smith NB，Bailey MR，et al. Overview of therapeutic ul-trasound applications and safety considerations［J］. J UltrasoundMed，2012，4: 623 － 634.
［2］ Jiang T，Xu T，Gu F，et al. Osteogenic effect of low intensity pulsedultrasound on rat adipose － derived stem cells in vitro［J］. J Hua-zhong Univ Sci Tech Med Sci，2012，32: 75 － 81.
［3］ Tapp H，Hanley E N，Patt J C，et al. Adipose － derived stem cells:characterization and current application in orthopaedic tissue repair［J］. Exper Biol Med，2009，1: 1 －9.
［4］ Locke M，Feisst V，Dunbar P. Concise review: human adipose － de-rived stem cells: separating promise from clinical need［J］. StemCells，2011，3: 404 － 411.
［5］ Lee S Y，Koh A，Niikura T，et al. Low － intensity pulsed ultrasoundenhances BMP － 7 － induced osteogenic differentiation of human frac-ture hematoma － derived progenitor cells in vitro［J］. J Orthop Trau-ma，2013，1: 29 － 33.
［6］ 郝偉，胡蘊玉，魏義勇，等 . 兔脂肪干細胞的分離培養鑒定及成骨誘導分化研究［J］. 中國矯形外科雜志，2006，21: 1657 －1660，1684.
［7］ 江渟，郭風勁，許濤，等 . 低強度脈沖超聲波對大鼠脂肪干細胞增殖及成骨分化的影響［J］. 中華物理醫學與康復雜志，2011，6: 408 － 412.
［8］ 王清富，陳莊洪，蔡賢華，等 . 兔脂肪干細胞的多向誘導分化［J］. 中國組織工程研究，2012，49: 9162 －9167.
