自 Wilmut 等獲得體細胞核移植后代“多利”以來,體細胞核移植技術獲得快速發展。Baguis 等\\( 1999\\) 采用體細胞核移植技術首次獲得了克隆山羊。此外,Keefer 等用外源基因轉染的體細胞為核供體,通過體細胞核移植方法獲得轉基因山羊。目前,利用體細胞核移植技術已成為制作轉基因動物的有效手段。為了建立通過山羊乳汁獲得抗菌肽\\( Antimicrobial peptides,ABP\\) 的方法,本研究利用在前期工作獲得的中國林蛙皮膚 ABP 的真核表達載體 Tem-GFP-pBC1,轉染山羊乳腺上皮細胞以獲得便于檢測并能在山羊乳腺特異表達 Tem-GFP 的轉基因陽性細胞。本研究進一步開展通過體細胞核移植獲得山羊乳腺特異表達 ABP 的轉基因山羊的相關研究奠定基礎。

1、 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗用細胞 山羊乳腺上皮細胞\\( 由東北農業大學高學軍教授饋贈\\)。

1.1.2 主要藥品和試劑 SalI\\( TaKaRa\\) ; 脂質體 Lipofectamine 2000\\( invitrogen\\) ; 基因組 DNA 提取試劑盒\\( TaKaRa\\) ; RNA 提取試劑 RNAiso plus\\( TaKaRa\\) 。

1.1.3 重組質粒 Tem-GFP -pBC1 利用前期工作中構建的重組質粒 Tem-GFP-pBC1,即在提取中國林蛙皮膚抗菌肽 Temporin-1CEa mRNA 基礎上,通過反轉錄獲得其 cDNA。利用 cDNA、pEASY-T3 克隆載體和 GFP 基因構建獲得山羊乳腺特異表達的重組質粒 Tem-GFP-pBC1。

1.2 實驗方法

1.2.1 山羊乳腺上皮細胞的傳代 采用常規方法,將冷凍保存的山羊乳腺上皮細胞經解凍復蘇后,在二氧化碳培養箱中\\( 37 ℃,5% CO2,飽和濕度\\) 進行培養。當細胞達到 90%以上匯合時,進行傳代培養。

1.2.2 山羊乳腺上皮細胞的轉染及轉基因陽性細胞的篩選 采用王春生等方法,用通過 SalI 單酶切后線性化的重組質粒 Tem-GFP-pBC1 或者空載體 pEASY-T3\\( 對照組\\) 對山羊乳腺上皮細胞進行轉染,48 h 后,利用含有 400 μg / mL G418\\( 預篩選的最佳濃度\\) 選擇培養基進行轉基因陽性細胞篩選。

1.2.3 轉基因細胞的鑒定 將上述獲得的轉基因陽性細胞進行傳代培養,觀察其細胞形態、生長曲線、冷凍復蘇后增殖特點等。此外,根據基因組 DNA 提取試劑盒說明提取上述篩選獲得的轉 Tem-GFP-pBC1 的陽性細胞的基因組 DNA。采用根據 Tem-GFP -pBC1 序列設計的引物\\( 5’-TCAAGGAGGATG-GCAACA-3’和 5’-GTGGACAGGTAGT GGTTATC-3’\\) 對細胞基因組 DNA 進行 PCR 檢測。

1.2.4 轉基因陽性細胞的 Tem-GFP 基因 RT-PCR 檢測 根據 Genbank 中山羊 GAPDH 基因序列和插入基因 Tem-GFP 序列,利用 Oligo6.0 和 Primer 6.0 軟件,分別設計 1 對 RT-PCR 引物\\( GAPDH: 5’-AT-CACTG CCACCCAGAAGACT-3’和 5’-CATGCCAGTGAGCTTCCCGTT - 3’; Tem -GFP: 5’-TCAAGGAG-GATGGCAACA-3’和 5’-GTGGACAGGTAGTGGT TATC-3’\\) ; 采用 Trizol 法分別提取轉染前后細胞的總RNA,并經反轉錄獲得 cDNA; 。聚合酶鏈式反應: 采用 25 μL 反應體系進行,反應混合物包括 10× buffer2.5 μL\\( 含 MgCl2\\) ,cDNA1.5 μL,引物各 0.5 μL,dNTP 0.5 μL,Taq 酶 0.3 μL,ddH2O 19.7 μL。反應條件為: 94 ℃預變性 5 min,94 ℃變性30 s,60 ℃復性30 s,72 ℃延伸30 s,30 個循環; 72 ℃延伸10 min 后保存于 4 ℃。擴增結束后,取 5 μL PCR 產物于 1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳,并用凝膠成像系統記錄結果。

2、 結果分析

2.1 乳腺特異性表達載體 Tem-GFP-pBC1 的線性化

將乳腺特異性表達質粒 Tem-GFP-pBC1 經 SalI 單酶切進行線性化,并通過瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定,其結果,與未經SalI 單酶切的 Tem-GFP-pBC1\\( 陰性對照\\) 的雙條帶不同,Tem-GFP-pBC1 經 SalI 單酶切后,僅能觀察到 1 條條帶\\( 圖 1\\) 。

2.2 轉染 Tem-GFP-pBC1 的山羊乳腺上皮細胞

當傳代培養的山羊乳腺上皮細胞\\( 圖 2\\) 達到 90%以上匯合時,采用脂質體法轉染經線性化的山羊乳腺特異表達載體 Tem-GFP-pBC1,其結果,在轉染后的第 24 h,在熒光倒置顯微鏡下可觀察到表達 GFP 的細胞,在轉染后的第48 h,約有 60%細胞表達 GFP\\( 圖 3\\) 。

2.3 轉基因陽性細胞的篩選

將上述經轉染 48 h 的轉 Tem-GFP-pBC1 陽性細胞,利用 G418 進行陽性細胞篩選,其結果,獲得在熒光倒置顯微鏡下發出綠色熒光\\( 表達 GFP\\) 的轉基因陽性細胞\\( 圖 4\\) 。

2.4 轉基因陽性細胞的鑒定

2.4.1 轉基因陽性細胞的形態 在熒光倒置顯微鏡下,轉基因陽性細胞\\( 圖 5\\) 和傳代培養的山羊乳腺上皮\\( 圖 2\\) 一樣,分散的細胞呈現梭形,而堆積存在的細胞呈現圓形或橢圓形。當細胞達到 90%以上匯合時,細胞的形態呈現圓形或橢圓形\\( 圖 6\\) 。

2.4.2 轉基因陽性細胞的生長曲線 將獲得的轉基因陽性細胞進行續培養時,于續培養后的第24 h 開始貼壁,前 4 d 生長緩慢,第 9 天時細胞匯合至約 90%,而第 10 天始趨于平穩,其生長曲線呈“S”形,符合細胞生長的生物學規律\\( 圖 7\\) 。

2.4.3 轉基因陽性細胞的冷凍復蘇后的生物學特性 將冷凍保存的轉基因細胞經復蘇后進行續培養,并在熒光倒置顯微鏡下觀察其形態,其結果,和正常傳代培養的山羊乳腺上皮細胞一樣,分散時呈現梭形,當到達 90%以上匯合時,呈現圓形或橢圓形\\( 圖未顯示\\) ; 當對復蘇的細胞進行續培養時,培養后 24 h 開始貼壁,前 4 d 生長緩慢,第 9 天時細胞匯合達到 90%以上,10 d 后趨于平穩,整個過程呈現“S”型\\( 圖 7\\) 。

2.4.4 轉基因陽性細胞的 PCR 鑒定 轉染 Tem-GFP -pBC1 后,收集利用含 G418 的培養基篩選的具有正常增殖能力的山羊乳腺上皮細胞,提取其基因組,利用特異性引物進行 PCR 擴增,可得與陽性對照\\( Tem-GFP-pBC1 質粒\\) 相一致的約 240 bp 的目的條帶\\( 圖 8\\) 。

2.4.5 轉基因細胞的 Tem-GFP 相對表達量的檢測 將 RT-PCR 的產物進行瓊脂糖凝膠電泳后,轉染前后 GAPDH 基因表達量持平,未轉染細胞沒有檢測到抗菌肽基因的表達,而轉染細胞可以檢測到與理論值一致的目的條帶\\( 如圖 9\\) 。

3 討 論

ABP 是廣泛存在于生物體內的一種由 20 ~ 60 個氨基酸構成的具有生物活性的小分子多肽由于 ABP 具有相對分子質量低、較好的水溶性、低抗原性和較強的熱穩定性,且抗菌肽是通過增加原核細胞膜的通透性而誘發抑菌或殺菌,不易引起病原體對其產生耐藥性等生物學特性。為了獲取 ABP的方法,許多學者探索了直接利用昆蟲、兩棲類動物組織等提取 ABP 的方法,但是,存在操作復雜、產量低、成本高等缺陷,難以獲得大量高純度的 ABP。

自 Simons 等首次利用轉基因小鼠的乳腺表達綿羊 β-球蛋白獲得成功以來,該項技術已不斷完善。以乳腺作為生物反應器大量生產生物活性蛋白變得可能。隨著體細胞克隆技術的不斷完善,通過外源 DNA 轉染的體細胞為核供體的體細胞核移植轉基因綿羊、牛、豬和山羊相繼獲得成功。上述結果表明,如果利用目的基因構建乳腺特異的表達載體,經轉染體細胞后獲得轉基因陽性細胞,再通過體細胞核移植的方法就有可能獲得目的基因在乳腺中特異表達的轉基因動物。

為了建立通過山羊乳汁獲得中國林蛙抗菌肽的方法,本研究在對前期工作中獲得山羊乳腺特異表達的真核表達載體 Tem-GFP-pBC1 轉染傳代培養的山羊乳腺上皮細胞,并經 G418 篩選獲得轉基因陽性細胞。其結果,將線性化的 Tem-GFP-pBC1\\( 圖 1\\) 轉染傳代培養的山羊成纖維細胞\\( 圖 2,3\\)后,經 G418 篩選獲得轉基因陽性細胞\\( 圖 4\\) ; 轉基因陽性細胞和經冷凍復蘇的轉基因陽性細胞進行續培養后,其細胞形態\\( 圖 5,6\\) 和生長曲線\\( 圖 7\\) 均正常; 經 PCR 檢測 Tem-GFP-pBC1 已整合入山羊乳腺上皮細胞的基因組中\\( 圖 8\\) ,且與對照組相比,轉基因細胞大量表達抗菌肽基因 Tem\\( 圖 9\\) 。

上述結果表明,本研究獲得了能夠在山羊乳腺中特異表達 Tem-GFP 融合蛋白的轉基因陽性細胞。能否利用該細胞通過體細胞核移植方法獲得乳腺特異表達中國林蛙抗菌肽的轉基因山羊有待于探討。