上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition,EMT）在胚胎發育、組織發生中起重要作用，并存在于多種慢性疾病的發病過程及腫瘤的浸潤轉移過程中。在多數腫瘤的原位、惡性腫瘤細胞向周圍組織侵襲和遠處器官轉移的過程中均存在EMT現象 。

EMT以上皮細胞極性的喪失及間質特性的獲得為重要特征，伴有多個細胞分子標志改變：上皮細胞標志物如E-鈣粘蛋白\\( E-cadherin\\)、β-連環素（β-catenin）等表達下調；間葉表型標記物如波形蛋白（Vimenin）、N-鈣粘蛋白（N-cadherin） 等表達上調；誘導EMT的細胞因子和轉錄因子如Snail、Slug、Twist等表達上調 。

透明質烷合酶2（hyaluronan synthases-2，HAS-2）是透明質烷（hyaluronan, HA 合成酶之一，在大腸癌、乳腺癌、卵巢癌、口腔癌、子宮內膜癌等多種腫瘤中均有表達。有研究表明，HA與HAS1-3與腫瘤的生物學過程密切相關，HAS-2能夠促進乳腺癌等腫瘤EMT的發生和發展 。本實驗擬通過RNAi干擾技術沉默HAS-2，研究HAS-2沉默前后對大腸癌細胞EMT的影響。

1、材料與方法

1.1 材料與試劑

人結直腸癌細胞株SW620購自中科院上海細胞生物學研究所細胞庫；siRNA購自于上海吉瑪基因公司；Lipofectamine LTX and PLUS Reagents、Opti-MEM培養基、RNA提取用Trizol試劑購自于InvitrogenTM公司；SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）、PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time 購自于Takara公司；兔抗人E-Cadhrein、Vimentin、Slug抗體購自于CST公司；小鼠抗人HAS-2抗體購自于Santa Cruz公司；小鼠抗人GAPDH抗體及辣根酶標記山羊抗兔IgG、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG二抗購自于北京中杉金橋公司。

1.2 細胞培養與轉染

人結直腸癌細胞株SW620用含10%胎牛血清的L-15培養基，于37℃無CO 培養箱中培養傳代，每22天換液1次，每3天傳代1次。取生長狀態良好的細5胞用于實驗。轉染前1天將2.5×10 對數期生長的細胞接種于6孔板，使細胞達到60~70%匯合。轉染前1h用不含新鮮胎牛血清（FBS）的L-15培養基饑餓細胞1h。將細胞分為未轉染組、轉染negative controlsiRNA的陰性對照組及轉染HAS-2 siRNA的實驗組,轉染4-6h后更換含10%FBS的L-15培養基。

1.3 流式細胞儀檢測轉染效率

將帶FAM熒光標記的陰性對照siRNA與LipofectamineLTX and PLUS Reagent按1：1、1:2、2:1的比例進行轉染，轉染后24h用0.25%胰酶消化細胞，1000轉/分離心機離心5min， PBS洗滌沉淀3次后用PBS吹懸細胞沉淀，用流式細胞液檢測轉染效率，轉染效率最高組用于以后實驗。

1.4 Realtime PCR檢測干擾效率

按轉染效率最高組進行轉染，轉染后24h后按RNAiso Reagent試劑說明書提取細胞總RNA，用TMPrimeScript RT reagent Kit（Perfect Real Time）試劑盒進行逆轉錄獲得cDNA，反應總體系為10μl 樣品總RNA≤500ng 體系如下： 5×Prime Script Buffer2μl, PrimeScriptTM RT Enzyme Mix 0.5μl, Random 6mers 0.5 l, Oligo dT Primer 0.5 l。反應條件：37℃15min, 85℃ 5s。以看家基因β-actin為內對照，通過相對熒光定量PCR方法應用Mx3000P定量PCR儀對HAS-2進行檢測, 計算出各組HAS-2的相對表達量，引物序列：Has-2上游引物：5' -CAGCCTCATCTGTGGAGATGGTAA-3'，下游引物：5' -CCAGAGGTCCACTAATGCACTGAA-3'；β-actin上游引物：5' -TGGCACCCAGCACAATGAA-3'，下游引物：5' -CTAATM，μ μGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'。反應條件：95℃5min 1個循環；95℃ 10s，58℃ 30s，40個循環。反應結束后計算機自動分析出定量結果，重復實驗3次，計算平均值。

1.5 Western blot檢測干擾效率

用冷PBS洗轉染后48h的細胞3次，在冰上用碧云天蛋白裂解液裂解細胞，30min內收集裂解液，12000rpm，4℃，離心15min，收集上清液中的總蛋白。應用碧云天BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量，取50 g總蛋白進行SDS-PAGE電泳，之后將蛋白應用濕式電轉法轉移到0.22 mPVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉后分別孵育HAS-2一抗及山羊抗小鼠IgG二抗，應用GAPDH作為內參，ECL發光液發光顯像。

1.6 RealtimePCR檢測E-Cadhrein, Vimentin, Snail mRNA表達

應用同前的方法，提取轉染后24h細胞總RNA并反轉錄為cDNA，用相對熒光定量PCR法分別對E-Cadhrein、Vimentin、Snail、β-actin進行檢測。引物設計合成于上海生工生物。引物序列如下：E-cadherin上游引物5' -GAGTG CCAACTGGACCATTCAGTA-3'，下游引物：5'-AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3'；Vimentin上游引物：5' -AGGAACAGCATGTCCAAATCG-3'，下游引物：5' -AAGGGCATCCACTTCACAGG-3'；Snail上游引物：5' -CGAAAGGCCTTCAACTGCAAAT-3'，下游引物：5' -ACTGGTACTTCTTGAACTCTG-3'。

1.7 Western blot 檢測E-cadherin、Vimentin、Slug蛋白質表達

應用同前的方法分別封閉E-cadherin、Vimentin、Slug一抗，檢測E-cadherin、Vimentin、Slug蛋白在各組細胞中的表達。

1.8 免疫熒光觀察細胞E-cadherin、Vimentin的表達

取轉染后48h的細胞爬片，冷PBS清洗3次，4%多聚甲醛冰上固定15min，冷PBS洗3次，0.5%Triton-PBS透膜5min，山羊血清封閉30min，分別于E-cadherin、Vimentin一抗4℃孵育過夜，次日取出復溫孵育1h，PBS洗3次，避光處加熒光二抗，37℃避光孵育1h，PBS洗3次，加DAPI室溫孵育2min，PBS洗3次，封片劑封片后熒光顯微鏡下照相。

統計學處理使用SPSS17.0完成，數據以均數±標準差， ＜0.05為差異具有統計學意義。

2、結果

2.1 HAS-2干擾效率，μμ解剖科學進展 2014年第20卷第3期x±sP轉染24h后用流式細胞儀檢測出轉染效率分別為66.7%、52%、68.1%。選擇1: 1轉染作為以后試驗轉染條件（圖1a、1b）。

細胞轉染24h后，與陰性對照組相比HAS-2siRNA轉染組的HAS-2 mRNA表達水平明顯下調，表達抑制率為 54.6±5.84 %（圖1c）。在蛋白水平，HAS-2蛋白在轉染后48h后表達水平亦明顯下調，表達抑制率為（40.5±5.32）%（圖1d）2.2 HAS-2 siRNA轉染后各組E-Cadherin、Vimentin、Snail mRNA的表達。

以陰性對照組作為參照，E-Cadherin mRNA在實驗組的相對表達量為（1.37±0.09），差別顯著（ ＜0.05）；Vimentin mRNA在實驗組的相對表達量為（0.64±0.06），差別顯著（ ＜0.05 ；SnailmRNA在H實驗組的相對表達量為（0.49±0.04），差別顯著（ ＜0.05，圖2）。

2.3 E-Cadherin、Vimentin、Slug蛋白表達水平的變化

HAS-2 siRNA轉染48h后，E-Cadherin蛋白在未轉染組、陰性對照組及實驗組的相對表達量分別為1.02±0.09、1、1.39±0.02，差別具有統計學意義（ ＜0.05\\)；Vimentin蛋白在這三組的表達分別為。1.11±0.13、1、0.40±0.05，差別具有統計學意義（ ＜0.05\\)；Slug蛋白在上述三組的表達分別為0.97±0.12、1、0.30±0.09，差別具有統計學意義（ ＜0.05，圖3）。

2.4 免疫熒光觀察結果

經饑餓處理后的爬片細胞行一抗及熒光二抗孵育及DAPI封片后經熒光顯微鏡觀察，可見未轉染組的細胞E-cadherin僅少量表達，實驗組E-cadherin表達較未轉染組細胞明顯增多（圖4A、4B），Vimentin在未轉染組表達較多，而在實驗組表達明顯減少（圖4C、4D）。

3、討論

大腸癌的侵襲與轉移是大腸癌難以根治并引起高死亡率的主要原因。研究表明，EMT是腫瘤細胞獲得侵襲和轉移能力的最主要途徑 。因此，研究誘導大腸癌發生EMT的關鍵分子及其可能的作用機制，從而研究出阻斷其機制的有效措施對大腸癌的治療及預后有著重要的臨床價值。大腸癌的侵襲、轉移是一個涉及多基因多步驟的復雜過程，HA與大腸癌的侵襲、轉移過程密切相關，HAS-2作為HA合成過程中的關鍵酶在大腸癌的侵襲、轉移中的作用不容忽視，其作用機制亦成為目前研究的熱點問題。

本研究所見HAS-2沉默后24h后，E-CadhreinmRNA水平較陰性對照組上調，Vimentin、SnailmRNA表達水平下調，由此表明，HAS-2沉默在mRNA水平對大腸癌細胞的EMT有抑制作用。轉染48小時后E-Cadhrein蛋白表達水平上調，Vimentin、Slug蛋白水平下調，證實在蛋白表達層面，HAS-2沉默同樣能夠抑制大腸癌細胞EMT。為了更進一步驗證HAS-2沉默對大腸癌細胞EMT的抑制作用，本研究應用免疫熒光檢測方法，同樣發現了轉染后E-Cadhrein表達上調，Vimentin表達下調，說明了HAS-2沉默對大腸癌細胞EMT具有抑制作用。綜上所述，HAS-2沉默能夠抑制大腸癌EMT的發生，從而發揮抑制大腸癌粘附、轉移的作用。由此推測，HAS-2可能有促進大腸癌細胞EMT的作用，HAS-2可能通過促進大腸癌細胞EMT從而促進大腸癌細胞的粘附、轉移。

HAS-2對大腸癌細胞EMT影響機制，尤其是細胞傳導信號通路的研究還有待于進一步實驗驗證和分析。很多研究表明：TGF-β是調控EMT 的主要機制。TGF-β通過Smad信號通路激活很多轉錄因子，如ZEB1、SIP1、Snail、Slug、Twist等，這些核轉錄因子能夠引起緊密連接蛋白如ZO-1和上皮生物標志物如E-cadherin等的表達下調，間質生物標志物Vimentin、N-cadherin等蛋白表達上調，使上皮來源的腫瘤細胞失去極性呈現纖維樣表型，黏附能力下降，細胞遷移和侵襲能力增強。TGF-β還可以通過激活TGF-β活化激酶TAK1，進而激活下游的一連串的信號傳導通路，如JNK、Erk、PI3K 及p38 MAPK激酶信號通路，并且獨立于TGF-β/Smad信號通路而發揮作用，誘導EMT的發生。Porsch H等 用TGF-β刺激NMuMG細胞（小鼠乳腺上皮細胞），之后用Realtime RT-PCR檢測出HAS-2 mRNA表達增加，而HAS-1、HAS-3的表達沒有變化，這表明在乳腺上皮細胞中，HAS-2在TGF-β誘導HA合成的過程中起主要作用，另外Porsch H等還發現在TGF-β誘導EMT產生的過程中HAS-2亦起到重要作用，利用HAS-2 siRNA沉默HAS-2，將顯著降低TGF-β所誘導的EMT。HAS-2在TGF-β誘導小鼠乳腺上皮細胞EMT中發揮了重要的作用，那么HAS-2在TGF-β誘導大腸癌細胞EMT中是否發揮了同樣的作用呢?

相關研究還有待于進一步的實驗求證，其發揮作用的主要通過信號傳導通路仍需進一步研究與探討。