1、 DXD-1菌體細胞的凝聚性

在液體培養基中，DXD-1很容易出現菌體細胞的團聚現象，對于具有凝集性質的發酵菌體來說，凝集性使菌體能在發酵結束時迅速沉淀，可降低分離菌體所耗的能源，但同時菌團的形成在一定程度上也會阻礙氧氣以及營養物質的運送，使得菌團內部的細胞處于缺氧以及營養不良的狀態，從而影響菌體的生長和產物的合成。所以探討DXD-1菌體細胞的凝聚性有利于優化菌體發酵合成代謝產物的能力，有利于進一步了解DXD-1菌體特性。

2、 菌體細胞凝聚的成因

很多真菌在搖瓶培養時都容易聚集成團，靜置后沉淀下來，所呈現出的顏色和形狀會隨菌種、培養基成分、接種量、裝液量、轉速的不同而不同。這種現象是否與外界環境條件的變化影響菌體細胞分泌出一定的物質造成細胞集聚性的改變有關?菌體細胞自身如何影響其凝聚性?對于大多數真菌來說目前還未見與此有關的詳盡報道?？梢钥隙ǖ氖蔷w細胞凝集與細胞周質成分密不可分。當前與菌體細胞周質有關的研究主要集中在凝集素、絮凝性微生物和生物被膜方面。

2.1 凝集素

凝集素是一類能促使細胞凝集的糖蛋白，它與糖的非共價結合是專一的、可逆的。它廣泛存在于自然界中，存在于各種動植物和微生物的細胞膜、細胞質和細胞外基質中。

2.1.1 凝集素的生物學效應

凝集素需要與凝集素受體特異性結合才能發揮其生物學效應。凝集素受體主要由糖蛋白組成，少數為糖脂或其他糖化物，一般位于細胞膜上。凝集素受體一旦與相應凝集素結合就會發生空間構型的變化．引起受體特性的改變，產生相應的生物學效應，如細胞凝集、貯存能量、抗病害、專一性識別等。

2.1.2 凝集素的提取分離工藝

目前凝集素以及凝集素單體的提取和分離純化都是依照蛋白質的提前分離方法進行的，一般先將提取物經硫酸銨分級沉淀后，再用離子交換樹脂或親和色譜來純化。李延清等用PBS緩沖液從馬鈴薯中提取凝集素粗提液。郭春生等采用生理鹽水和磷酸緩沖液對蕓豆浸提后用硫酸銨沉淀獲得蕓豆植物凝集素。袁燕等提取蒜頭中的凝集素采用的是硫酸銨分段鹽析法，而張濤等共沉淀紅蕓豆和甲狀腺球蛋白的粗提取液后進行超濾可制備高純度的紅細胞凝集素，具有高效，高產品純度和高活力的特點。

2.2 絮凝性微生物

微生物絮凝劑也屬于微生物次生代謝產物中的一種，這種次生代謝產物具有絮凝活性。絮凝性微生物的菌體細胞自身通常能互相粘附形成絮狀沉淀而達到分離的目的。釀酒酵母是典型的能使自身細胞發生凝聚的微生物，它的凝聚特性研究可以作為DXD-1 菌體的借鑒。

2.2.1 釀酒酵母的凝聚特性

酵母細胞凝聚的形式有3種：\\(1\\)酵母細胞芽殖時與母細胞連成細胞鏈形成凝聚。\\(2\\)酵母細胞有性繁殖時通過表面特殊的蛋白連接形成凝聚。\\(3\\)酵母細胞之間通過細胞壁上的特定蛋白與甘露糖殘基的專一性結合形成的無性絮凝。該特定蛋白類似于外源凝集素，被稱為“絮凝素”，編碼絮凝素的基因稱為絮凝基因。

2.2.2 酵母絮凝的影響因素

影響絮凝的因素除了菌株自身還有很多非遺傳因素。如細胞壁成分、細胞表面特性、培養時間、接種量、營養成分、溶氧、溫度、蛋白質變性劑、無機離子、細胞間相互作用力等。以往的研究結果表明，防止微生物絮凝在某些程度上能促進微生物的生長，原因是增加了游離細胞與培養液中營養物質的接觸面積。絮凝不是微生物生命活動所必需的，有可能只是為了應對外界環境的變化而形成。

2.3 生物被膜

生物被膜是指菌體在繁殖、分化時由自身分泌的多糖基質及各種蛋白在細胞表面高度組織化系統化聚集所形成的膜樣聚合物。目前研究較多的是細菌生物被膜和有害真菌的生物被膜。生物被膜是菌體在惡劣環境中形成的一種保護機制，被生物被膜包裹的菌體通常會因為營養物質的缺乏而生長緩慢。

2.3.1 生物被膜的鑒定

生物被膜的組成成分復雜且差異較大，常含有多糖基質、代謝產物及環境中特殊物質或碎屑等。細菌生物被膜的鑒定方法通常有試管法、銀染法、掃描和透射電鏡法、激光共聚焦掃描顯微鏡法和微量板定量檢測法等，這些方法各有優缺點。

2.3.2 生物被膜的解離

生物被膜一旦形成就很難去除，生物被膜若發生解離通常有兩種情況：\\(1\\)環境變化不利于微生物的生存，引發微生物的死亡。\\(2\\)環境變化更有利于微生物的快速生長。目前生物被膜的降解只有通過菌體自身產生的特異性降解酶來進行，還沒有其它有效的人工方法。

3、 DXD-1菌體細胞凝聚的初步研究方案

在目前對細胞周質物質研究的基礎上，初步確定研究DXD-1菌體細胞凝聚的方法如下：

3.1 確定菌體細胞絮凝成分的大致類型

對DXD-1菌體細胞周質成分進行分析，凝聚素多是糖蛋白，而生物被膜則多是成分復雜的混合物?？梢韵扔脦追N簡單的蛋白酶處理凝聚著的DXD-1菌體，如果菌體很容易分散則多是凝集素。如果凝聚程度沒明顯變化則進行生物被膜的分析方法。

3.2 形成生物被膜引起凝聚的研究方案

3.2.1 優化DXD-1菌體培養條件

如果絮凝原因是因為菌體形成了生物被膜，則證明培養條件可能不適宜菌體生長。鑒于生物被膜成分的復雜性，優化培養條件是解決絮凝因素的主要途徑。

3.2.2 推測真菌生物被膜形成機制

現有的研究成果表明，在生物被膜內，菌體之間存在著信息傳遞。菌體分泌胞外復合物形成完整生物被膜結構是某些基因被信息分子活化的結果。探明這些基因的序列及影響表達調控的因素具有重要意義，對DXD-1進行分子生物學研究可以了解真菌生物被膜的形成機制。

3.2.3 有益菌生物被膜的進一步研究

微生物的生物被膜具有較強的抗逆性，能抑制金屬腐蝕，能夠產生抗菌物質，可以形成生物表面活性素保護植物免受病原菌侵害，作為污水處理中生物被膜反應器，研究生物被膜的開發和應用在現代工業和農業生產上有重要的意義。目前生物被膜的研究對象大多是有害菌，關于對有益菌的生物被膜的研究還很少見，DXD-1作為能產油脂的對環境友好的有益微生物，有望成為生產生物被膜的儲備菌。

3.3 凝集素造成菌體凝聚的研究方案

\\(1\\)按凝集素的提取方法粗凝集素液，配制凝集素提取緩沖液浸泡離心后的菌體一段時間后再離心得到粗提液。將此粗提液采用透析方法濃縮后加入到分散的酵母細胞或動物紅細胞中觀察是否出現凝集反應。

\\(2\\)對該粗提液做糖抑制實驗，該實驗可考察與凝集素糖蛋白結合的糖的種類，從而可以推測出發酵培養過程不同碳源對菌體細胞凝聚的影響。

\\(3\\)對該粗提液進行成分分析。SDS-PAGE電泳分析凝集素的分子量，并用色譜或質譜技術分析蛋白質和糖的種類，以確定凝集素成分。

\\(4\\)利用基因工程的手段參照已有的酵母絮凝基因研究方法構建DXD-1絮凝基因組文庫. 從文庫中篩選重組子獲得表達絮凝活性的克隆子，并進行序列分析得到DXD-1的絮凝基因。

\\(5\\)對所獲得的DXD-1絮凝基因進行遺傳改造，使絮凝基因失活或控制絮凝基因只在發酵結束時表達，而不在發酵的早期及中期表達。

實驗室已有的研究表明DXD-1是一株高產油真菌，具有工業化生產的潛力。其凝聚特性在一定程度上阻礙了發酵的進行。鑒于目前釀酒酵母絮凝特性的研究和在工業上的應用，有望解決DXD-1在發酵過程中絮凝的缺點，并借助基因工程的手段賦予DXD-1在發酵后期表達誘導型絮凝基因的能力，以方便在工業化生產發酵后期菌體的分離和回收利用。

參考文獻：
[1]潘進權，劉耘．菌絲結團問題的探討[J]．中國釀造，2002\\(4\\)：33-34．
[2]戴聰杰．甲殼動物血清中凝集素對微生物細胞的凝集性能[J]．海洋科學，2003，27\\(10\\)：63-67．
[3]趙寅生．凝集素生物學功能及應用[J]．安徽農業大學學報，2001，28\\(4\\)：445-447．
[4]侯玉芳，李繼昌，張德顯，等．凝集素的提取純化及其在獸醫臨床上的應用[J]．中國獸醫雜志，2010，46\\(2\\)：62-64．
[5]李延清，孫志宏，劉長海，等．馬鈴薯凝集素的凝集作用及其影響因素[J]，黑龍江畜牧獸醫，2004\\(8\\)：71-72．
[6]郭春生，于蕾妍，葛蔚等蕓豆植物凝集素的提取及血凝效果研究[J]．中國獸藥雜志，2008，42\\(1\\)：49-50．
[7]袁燕，袁再美，岑曉江，等．蒜頭果凝集素的提取及血凝效果研究[J]．中國農學通報，2011，27\\(21\\)：144-146．
[8]張濤，楊雨晗，何濤，等．親和共沉淀從紅蕓豆中提取紅細胞凝集素及其性質研究[J]．中國生化藥物雜志，2011，32\\(3\\)：202-205．