國家自然科學基金委員會生命科學部、醫學科學部與政策局于2014年11月24~26日在南京聯合舉辦了第128期雙清論壇。 本次論壇的主題為"生殖生物學研究的挑戰和對策", 重點關注動物和人的生殖， 論壇執行主席由中國科學院上海生命科學研究院張永蓮院士、南京醫科大學沙家豪教授和北京大學喬杰教授共同擔任。 來自國內22家主要研究單位的68位生殖生物學、生殖醫學、生殖干細胞、流行病學等領域專家參加了本次論壇。 論壇安排了4個主題報告和33個專題報告， 圍繞"精子發生與成熟"、"卵泡發育與受精"、"胚胎發育與出生缺陷"和"基礎與臨床研究新技術"4個議題進行了研討。 論壇的鮮明特點是參會專家基于已有工作， 談設想、談領域發展。 在會議報告和分組討論中， 專家們暢所欲言， 通過不同學術觀點的碰撞和交流， 圍繞生殖生物學的研究現狀、發展趨勢及面臨的挑戰等進行了較深入和全面的分析研討， 對我國生殖生物學研究的發展提出了很好的意見和建議。

1 生殖生物學研究的現狀

生殖是生物的最基本特征之一， 是生物體繁衍后代、維系物種延續的重要過程。 生殖生物學的基礎研究主要集中于配子形成機制， 受精與早期胚胎發育機理， 以及胚胎植入和妊娠維持； 而其應用基礎研究涉及人的不孕不育、出生缺陷、計劃生育， 以及農業動物的繁育等國家重大需求[1]. 近年來， 隨著研究方法和技術的突破， 特別是分子技術、基因組技術、高分辨率成像技術和譜系追蹤技術的發展， 生殖生物學研究得到快速發展， 其現狀和研究熱點表現在以下4個方面。

1.1 配子形成及體外誘導的研究不斷取得新進展

配子形成是有性生殖的根本， 是生殖調控的關鍵[2]. 配子由原始生殖細胞經增殖、減數分裂、成熟而產生， 整個過程不僅受本身遺傳和表觀遺傳的調控， 還受鄰近細胞或組織及微環境的影響[3]. 減數分裂是生殖細胞獨有的分裂方式， 是配子形成的關鍵和核心， 其重要過程包括減數分裂的啟動以及同源染色體的識別、配對、聯會、重組和分離[4], 這一系列過程的正常進行確保了遺傳物質在生物世代間的穩定傳遞和有規律的變異， 使物種得以繁衍和進化。

從本質上講， 性原細胞減數分裂的啟動就是有絲分裂向減數分裂的轉換， 對減數分裂起始機制的深入認識是實現生殖細胞體外分化的關鍵。 已有研究表明， 調控轉換機制在不同的生物中表現出很大的差異， 現在尚不清楚性原細胞的有絲分裂是如何被抑制并在極短的發育窗口期內進入減數分裂的。 研究結果顯示， 同源染色體的識別、配對、聯會、重組和分離的正確進行依賴于減數分裂前期的一個特殊步驟， 即程序性的DNA雙鏈斷裂（double strand break,DSB）及其修復。 伴隨著DSB的修復， 生殖細胞中的同源染色體實現了相互識別、配對， 并聯會形成聯會復合體（synaptonemal complex, SC）。 聯會復合體把同源染色體緊緊地結合在一起， 為同源染色體的互換（crossover, 又稱重組）提供了保障。 目前有待澄清的問題是， 哪些基因/蛋白質參與上述過程、它們是如何按時依序調控DNA斷裂、修復和同源染色體的識別、配對、聯會、重組和分離的。 發現新調控因子和作用方式， 將有助于闡明調控減數分裂啟動和染色體行為的分子機制， 為生殖細胞體外誘導提供新思路， 也為無精子癥的無創診斷和卵胞漿內單精子顯微注射（intracytoplasmic sperm injection, ICSI）胚胎的遺傳篩查提供候選分子。

精原干細胞是雄性生殖力維持的基礎， 利用精原干細胞來保存雄性生育能力是當前的研究熱點，而誘導精原干細胞分化形成功能精子也是本領域亟待突破的重要方向。 早在20年前， 通過異體移植實驗已經證實， 精原干細胞在體內具有再生能力。 10年前，小鼠（Mus musculus）精原干細胞的分選富集和體外長期增殖獲得成功。 目前， 通過生精小管的體外培養已能獲得由精原干細胞分化形成的功能精子， 但這方面工作還僅限于小鼠， 且是部分體外誘導的。 對于精原干細胞的對稱和不對稱分裂， 以及自我更新和分化之間的動態平衡是如何維持的， 精原干細胞的微環境和干細胞之間互作機制等還了解不多。

除小鼠、大鼠（Rattus norvegicus）、倉鼠（Cricetidae）和家兔（Leporidae）外， 其他物種尤其是靈長類動物， 其精原干細胞的體外長期增殖還未獲得成功。 對于雌配子而言， 一直認為哺乳類成年卵巢中不存在生殖干細胞， 但近年來有報道顯示， 成年人和小鼠的卵巢中存在卵原干細胞。 目前， 成年卵巢中是否存在生殖干細胞還存在爭議。 在體外誘導生殖細胞方面， 自2003年起， 已有多項研究成功地將哺乳動物的胚胎干細胞，包括人類（Homo sapiens）胚胎干細胞， 誘導為不同發育階段的生殖細胞， 但獲得的生殖細胞多屬早期生殖細胞， 減數分裂是否啟動或進行尚不明確。 直到2009年， 科學家們在高表達DAZL（deleted in AZoo-spermia-like）家族基因后， 發現人類胚胎干細胞能被誘導形成單倍體精細胞。 隨后的研究發現， 人類皮膚來源的誘導多能性干細胞（induced pluripotent stemcells, iPSCs）也能分化為單倍體生殖細胞。 目前， 將體細胞來源的干細胞誘導分化為雌性生殖細胞的研究還比較少。

表觀遺傳是生命活動的重要調控方式， 也是近年來生殖生物學領域的研究熱點。 配子發生及早期胚胎發育過程中發生了許多表觀遺傳重塑， 這些過程是研究表觀遺傳調控方式和機理的較理想體系。

表觀遺傳主要涉及DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA等。 近年來， 我國科學家在該領域獲得了一系列突破性研究進展， 例如， 闡釋了5-甲基胞嘧啶的去甲基化機制[5], 發現子代繼承親代DNA甲基化圖譜的新規律[6], 揭示了精子發生過程中單倍體基因組中大量的組蛋白降解依賴于乙?；閷У奶禺愋缘鞍酌阁w通路， 發現粗線期piRNA在指導精子形成后期mRNA的大規模清除中發揮關鍵作用。 盡管長度小于50個堿基的非編碼RNA（如microRNA和piRNA）的研究已取得了突破性進展， 但對新近發現的數以萬計的長鏈非編碼RNA（lncRNA）有何作用以及如何起作用， 則不清楚。 lncRNA在各物種睪丸組織中高度富集， 且在精子發生中呈階段特異性變化， 提示其在精子發生過程中可能發揮重要作用。 在這一領域，重要的科學問題包括， 精子發生過程中特異性lncRNA在精子發生中有何功能， 以及通過何種機制發揮作用等。

1.2 出生缺陷和不孕不育研究是國家重大需求

中國是人口大國， 也是出生缺陷和殘疾高發的國家。 出生缺陷不僅是人口健康問題， 而且已成為影響人口素質和國家持續發展的重大問題。 大多數出生缺陷源于早期胚胎的異常發育， 也與環境、遺傳、表觀遺傳和行為等因素密切相關[7].

由于對早期胚胎發育的調控機制了解不多， 現在還無法對胚胎和胎兒進行診斷， 更談不上對流產和出生缺陷進行預防和干預。 近期， 基因組學和細胞生物學的一系列進展， 特別是我國科學家一系列出色的工作， 為早期胚胎的分子診斷和對癥治療提供了可能， 例如， 利用單細胞RNA測序技術建立早期胚胎發育各時期的基因表達譜[8], 比較和篩查出現的問題； 采用單細胞DNA測序對單個卵子進行無損檢測[9], 實現植入前診斷； 通過構建人類早期胚胎全基因組DNA甲基化調控網絡， 深入認識表觀遺傳調控機制， 評估與改進輔助生殖技術， 實現臨床上疑難病例的診治； 在遺傳性線粒體疾病方面， 我國科學家發現由極體細胞核與卵母細胞核置換產生的子一代小鼠及其產生的子二代小鼠體內僅含供體小鼠的線粒體， 借此可在最大程度上避免母源線粒體DNA遺傳病的發生， 該成果的臨床應用有望預防母源性線粒體遺傳疾病的發生； 通過大規模測序和全基因組關聯研究（genome-wide association study, GWAS）， 發現復雜疾病/性狀易感變異。 近年來， 圍繞配子發生異常所導致的重大生殖障礙疾病， 如多囊卵巢綜合征、卵巢早衰和無精子癥、少弱畸形精子癥等， 我國科學家篩選出了一批易感基因位點， 并率先報道了人類卵子透明帶缺失病例， 并成功破譯其致病突變（位于11號常染色體 , 人類基因庫登記編號為 KJ489454）。

上述致病突變或易感基因位點的發現為理解人類配子發生異常的機制提供了新的認識， 同時也為揭示配子發生的調控機制帶來了新的希望。 下一步的研究重點將是， 發現導致配子發生異常的候選突變， 證實突變在疾病發生中的作用， 深入闡明其致病機理，為預防、分子診斷和靶向治療提供理論基礎。

20世紀80年代， 英國著名學者David Baker教授就提出了"胎源性疾病"的概念。 近10年來， 在胎兒期或胚胎植入前不良環境暴露和出生缺陷、少兒疾?。ㄈ绱x綜合征等）、成年期慢性疾?。ㄈ缣悄虿?、神經精神性疾病等）之間的相關性開展了大量研究。 我國科學家也報道了妊娠期糖尿病所致的宮內高糖環境對子一代及子二代小鼠糖代謝的影響。 胚胎源性疾病能否早期預警與有效干預， 直接關系到子代的預后、生存質量及成年期健康狀態[10].

妊娠失敗是導致生殖障礙和不孕不育的另一重要因素， 其主要原因是胚胎著床或胎盤發育障礙。 成功妊娠是一個系統的生理進程： 胚胎種植到母體子宮之前， 子宮內膜細胞發生分化， 使子宮處于可以接納胚胎的狀態； 胚胎植入后， 胎兒與母體之間需形成一個由多種不同細胞類型組成的臨時性內分泌器官--胎盤來維持胎兒的生長發育； 胚胎及胎兒攜有遺傳自父系的同種異體抗原， 這一異體抗原不僅不被母體免疫排斥， 反而形成免疫耐受， 其間涉及廣泛復雜的母-胎間交互對話。 近期， 我國科學家揭示了胚胎植入時母-胎分子對話的一個重要參與者--上皮細胞中的離子通道， 并且在人類不孕不育的疾病中得到驗證。 除早期妊娠失敗外， 中晚期妊娠并發癥， 例如， 胎兒宮內生長受限、子癇前期等， 發病率居高不下， 也是造成極高的母兒死亡率， 以及患者及其后代遠期較高糖尿病、心血管疾病等患病率的重要原因之一。 已有研究顯示， 多種重要妊娠疾病的發生必然伴隨著妊娠適應性變化的失調， 但對于母胎識別和妊娠適應性的關鍵問題， 即妊娠過程中介導胎盤/胎兒與母體多系統/多器官之間協調對話的分子機制， 還缺乏深入認識。 深入闡明其機制需要生殖生理和病理領域與能量代謝、心血管、凝血等領域的深度合作。

1.3 環境污染對生殖健康的影響逐漸受到人們重視

人的生殖過程十分復雜， 對環境也特別敏感。 環境暴露直接影響配子的形成、成熟、受精以及胚胎和胎兒發育等過程， 引起生殖功能障礙和出生缺陷等。

近年來， 國際頂級期刊如Nature, Science, Cell和NEngl J Med等陸續刊出了基于人群隊列和動物模型的生殖發育研究成果。 然而， 大多數研究結果還亟需準確的人群研究結果來證實， 因此， 需要建立前瞻性的大樣本出生隊列， 從親代配子發生、成熟、精卵結合、胚胎植入、胚胎發育、子代生長發育直至生殖傳代效應， 獲得包括遺傳、表觀遺傳和環境信息， 以及各類生殖發育結局在內的全方位信息。 此外， 影響生殖的環境因素復雜多樣， 包括化學、物理、生物、社會心理等因素。 這些因素可能通過不同機制導致不良生殖結局、引起子代兒童期直至成年期的疾病和異常， 因此， 在研究中需要采用綜合性的環境暴露評估手段。 隨著各類組學技術的不斷發展和融合， 暴露組和代謝組等組學的聯用， 以及對孕前、孕中、新生兒期等人群樣本分階段的分析， 將有助于確定環境暴露對生殖健康影響的確切時期和影響因素， 深入揭示影響機制。

近年來， 生殖環境暴露的遠期健康效應日益受到關注。 Michael Skinner實驗室2007年報道了懷孕期間暴露在乙烯菌核利（vinclozolin）中的雌性大鼠生下的雄性后代出現精子發生異常， 這種變化可以在雄性大鼠的后代中遺傳4代， 表明環境引起的表觀遺傳改變可進行跨代傳遞。 在2010年， 兩個實驗室分別獨立地在Nature和Cell上報道了父代飲食可影響子代成年后的代謝狀況， 這些發現激起了人們對環境因素通過影響配子而影響子代健康的關注， 但這一現象背后的分子機理尚不明確， 表觀遺傳的跨代傳遞可能是目前對于這一現象的較好解釋。 從理論上講， 精子的DNA甲基化、染色質結構、各種非編碼RNA及其RNA修飾譜都可能是潛在的表觀遺傳信息攜帶介質[11], 我國科學家近期在哺乳動物成熟精子中發現了一類進化上保守、來源于tRNA5′端序列、且高度富集的新型小 RNA: tsRNAs（tRNA-derived smallRNAs）， 這些tsRNAs可通過核苷酸修飾維持其穩定性， 且在機體應激等情況下發生變化。 鑒于tsRNAs在精子中高度富集并可在受精時進入卵子， 以及非編碼小RNA廣泛的調控功能， tsRNAs及其RNA修飾很可能作為一種表觀遺傳信息的載體， 將環境因素導致的表觀遺傳改變經配子傳遞到子代。 基于出生隊列的表觀遺傳學研究將為環境暴露的傳代效應機制的研究提供可靠的方法和途徑。

1.4 新技術和大動物模型在生殖生物學研究中日趨重要

生命科學研究的任何重大突破均離不開技術和方法的革新。 近年來， 基因組學技術、單細胞測序技術、基因修飾技術等新技術在生殖生物學研究得到成功應用， 產生了一系列重大成果。 2012年， 美國科學家利用單精子基因組測序， 發現減數分裂重組位點在染色體上不是隨機分布的， 這些重組"熱點"可以幫助生物學家繪制出與疾病相關的遺傳變異圖譜。

我國科學家利用單細胞測序技術對小鼠及人的卵細胞和早期胚胎的轉錄組、基因組進行了解析， 并通過胚胎的植入前篩查， 成功地培育出世界首例排除了相應單基因缺陷的試管嬰兒。 CRISPR/Cas9（clusteredregularly interspaced short palindromic repeats/CRISPassociated 9）基因組編輯技術以其簡便高效的特點，迅速成為國際生命科學研究領域的熱點。 我國科學家成功運用這一技術率先構建了基于CRISPR/Cas9技術的基因修飾大鼠、豬（Sus scrofa）等動物模型， 特別是建立了基于這一新技術的基因修飾靈長類動物模型， 為研究人類生殖疾病、回答人群生殖中的重大基礎問題提供了關鍵平臺。 此外， 利用CRISPR/Cas9技術， 我國科學家成功地在小鼠精原干細胞中修復了遺傳缺陷， 獲得了健康的后代。 建立哺乳動物單倍體細胞系一直是生物學家們夢寐以求的目標。 近年來， 單倍體胚胎干細胞的研究也獲得了重要突破，2011年， 國外科學家成功地利用小鼠孤雌發育的囊胚建立了單倍體胚胎干細胞系。 2012年， 我國的兩個研究團隊分別利用小鼠孤雄囊胚建立了單倍體胚胎干細胞系， 并證明這些細胞能使卵母細胞"受精"并產生健康小鼠。 隨后， 我國科學家又分別于2013和2014年建立了食蟹猴（Crab-eating Macaque）和大鼠的單倍體胚胎干細胞。 哺乳動物單倍體干細胞的建立將為生殖生物學研究帶來新的研究工具和手段。

2 未來關注的科學前沿

本次論壇在分析學科發展的同時， 重點討論了我國亟需加強的重要學術方向和關注的科學問題。